La metabolómica del plasma revela cambios importantes en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas de terneros destetados abruptamente

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8176 (2023) Citar este artículo

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Se utilizó la metabolómica basada en 1H RMN para estudiar el efecto del destete abrupto en el metaboloma sanguíneo de los terneros. Veinte terneros Angus (258 ± 5 kg BW; 5 a 6 meses de edad) fueron asignados aleatoriamente a un grupo no destetado (NW) que permaneció pastando con su madre o un grupo destetado (W) que experimentó una separación abrupta de su madre a un potrero separado en el día 0 del estudio. El peso corporal, el comportamiento y las muestras de sangre para cortisol y metabolómica se midieron en los días 0, 1, 2, 7 y 14 del estudio. En los días 1 y 2, los terneros W pasaron menos tiempo pastando y rumiando, y más tiempo vocalizando y caminando, tenían una mayor concentración de cortisol, NEFA, 3-hidroxibutirato, betaína, creatina y fenilalanina, y menor abundancia de tirosina (P < 0.05) en comparación con los terneros NW. En comparación con los terneros NW en el día 14, los terneros W tenían una mayor abundancia relativa (P < 0,01) de acetato, glucosa, alantoína, creatinina, creatina, fosfato de creatina, glutamato, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxiisobutirato y siete AA (alanina, glutamato , leucina, lisina, fenilalanina, treonina y valina) pero menor (P < 0,05) abundancia relativa de lípidos de baja y muy baja densidad, y lípidos insaturados. Tanto PCA como OPLS-DA no mostraron agrupamiento ni discriminación entre grupos en el día 0 y aumentaron la divergencia hasta el día 14. La metabolómica sanguínea es una herramienta útil para cuantificar los efectos agudos del estrés en los terneros durante los primeros 2 días después del destete abrupto y a más largo plazo. Cambios a largo plazo en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas debido a cambios nutricionales por el cese del consumo de leche y una mayor dependencia del consumo de forraje.

Los requerimientos nutricionales de los terneros de carne recién nacidos y pre-rumiantes se satisfacen exclusivamente a partir de proteínas, grasas, carbohidratos (principalmente lactosa), vitaminas y minerales absorbidos de la leche que no pasa por el rumen no desarrollado1. La transición de la etapa pre-rumiante a la rumiante en terneros criados en pastos ocurre gradualmente a medida que aumenta el consumo de alimentos sólidos y la fermentación del rumen y el animal se vuelve más dependiente de proteínas microbianas y AGV2,3. Una de las características más destacadas del animal rumiante es el alto potencial gluconeogénico del propionato, lactato y AA1. La remoción abrupta de un ternero de su madre (destete) entre los 3 y 6 meses de edad es una práctica estándar en los sistemas de producción de ganado de carne4. Los terneros destetados pueden experimentar estrés nutricional, social y psicológico que provoca cambios conductuales, metabólicos, fisiológicos e inmunológicos5,6. Por lo tanto, las prácticas de destete deben considerar el bienestar animal, la función metabólica y los requerimientos nutricionales de los terneros2. Estudios previos se han centrado en los cambios de comportamiento, hormonas del estrés e inmunología de los terneros destetados, que son más evidentes durante las primeras 48 h tras el destete5,7,8,9. El efecto catabólico de las hormonas del estrés, como el cortisol, puede explicar el aumento de las concentraciones de NEFA en la sangre y parte de la disminución de la ADG después del destete10,11. Sin embargo, se espera que el cese del consumo de leche de los terneros en pastoreo produzca cambios metabólicos a más largo plazo porque la grasa de la dieta se reduce debido a la baja concentración en los forrajes, mientras que la fibra y la fermentación ruminal aumentan. Sorprendentemente, se sabe poco sobre los cambios en la función metabólica de los terneros en pastoreo después del destete. Esta información podría usarse para desarrollar nuevas estrategias para aliviar el estrés metabólico, mejorar el bienestar y minimizar la disminución de la producción animal después del destete.

La función metabólica se refleja en el metaboloma sanguíneo que comprende metabolitos como lípidos, azúcares y AA que influyen en la función celular, tisular y orgánica12,13. El metaboloma está aguas abajo del genoma, el transcriptoma y el proteoma, y es el 'ómico' más cercano al fenotipo. Esto llevó a sugerir que el metaboloma puede ser el mejor indicador de alteraciones en la función biológica14,15,16. Otra característica importante del metaboloma sanguíneo es que representa la integración de factores externos (p. ej., dieta) e internos (p. ej., genotipo) que influyen en el metabolismo15. En cerdos, el destete se asoció con cambios tanto en la función metabólica como en el metaboloma sanguíneo y estos cambios podrían contrarrestarse parcialmente con la suplementación con arginina17. Un estudio anterior informó que los terneros recién nacidos alimentados con calostro mostraron un aumento en la abundancia sérica de glutamato, histidina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, valina, leucina, isoleucina y prolina, y una reducción de la glutamina13. Sin embargo, no se publicaron estudios que evaluaran los cambios en el metaboloma sanguíneo de terneros de carne en pastoreo después del destete en condiciones comerciales.

El objetivo del presente estudio fue caracterizar los cambios en el metaboloma sanguíneo de terneros de carne Angus sometidos a un destete abrupto. Esta información podría mejorar nuestra comprensión del impacto metabólico del destete abrupto en terneros de carne e informar estrategias novedosas para manejar la transición. La hipótesis fue que el destete abrupto en terneros de carne estaba asociado con estrés y cambios nutricionales que producen respuestas metabólicas reflejadas en el metaboloma sanguíneo.

El estudio contó con la aprobación de ética animal del Comité de Ética Animal de la Universidad de Sydney: Protocolo 767. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con la aprobación ética y las leyes, reglamentos y códigos estatales y nacionales pertinentes, incluida la Ley de investigación animal de 1985 (https://www. dpi.nsw.gov.au/about-us/legislation/list/animal-research), Reglamento de investigación animal 2021 (https://legislation.nsw.gov.au/view/pdf/asmade/sl-2021-477) y el código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos, octava edición de 2013 (https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes ).

Veinte vacas Angus multíparas y sus crías (de 5 a 6 meses de edad) se mantuvieron bajo condiciones de pastoreo y manejo estándar en la Granja John Pye de la Universidad de Sydney (Greendale, Nueva Gales del Sur, Australia). Los pastos estaban dominados por Paspalum (Paspalum dilatatum) con densidades relativamente bajas de Achicoria (Cichorium intybus), Plátano (Plantago lanceolata), Trébol rojo (Trifolium pratense) y Trébol blanco (Trifolium repens) y contenían 10,7% PB, 60,7% FDN, y 20,6% FAD. Los terneros nacieron en primavera y habían permanecido con su madre desde el nacimiento.

En el día 0, los terneros se pesaron, se dividieron por sexo y se asignaron aleatoriamente a un grupo no destetado que permaneció con su madre (NW; n = 10; 257 ± 6 kg BW) o un grupo destetado que se separó abruptamente de su madre. (W; n = 10; 258 ± 5 kg BW) y enviados a un potrero separado sin contacto visual ni auditivo con su madre. Cada grupo tenía 7 terneros machos (no castrados) y 3 hembras. El pasto en los dos potreros fue similar en composición y cantidad. Esto se verificó mediante muestreo y análisis de pastos al inicio (d 0) y al final (d 14) del estudio. Para ello, se distribuyeron aleatoriamente diez cuadrantes (0,5 m × 0,5 m) en cada potrero y el forraje dentro de los cuadrantes se cortó a nivel del suelo, se secó durante 48 h a 65 °C y se pesó para calcular la biomasa forrajera disponible. Los dos grupos de terneros permanecieron en sus respectivos potreros desde el día 0 hasta el final (día 14) del estudio. Se registró el peso corporal de todos los terneros en los días 0, 2, 7 y 14. Se recolectaron muestras de sangre por venopunción yugular utilizando tubos de vacío que contenían EDTA (BD Vacutainer, Becton Dickinson, NJ, EE. UU.) en los días 0, 1, 2, 7, y 14 entre las 09:00 y las 10:00 horas. Las muestras se refrigeraron a 4 °C durante aproximadamente 30 min, se centrifugaron (2000 × g durante 30 min) y el plasma se almacenó a -80 °C hasta el análisis metabolómico.

El comportamiento se midió mediante muestreo de exploración a intervalos de 3 min para cada animal en los días - 2, - 1, 0, 1, 2, 7 y 14 en relación con el día del destete (d 0). Las observaciones se realizaron directamente en el campo utilizando una hoja de registro que contenía el número de animal, la fecha y la hora (a intervalos de 3 min), mientras que el comportamiento realizado por los animales fue registrado por dos observadores durante los períodos: 7 a. m. a 9 a. m., 11 a. m. a 13:00, 14:00 a 16:00 y 17:00 a 19:00 Las conductas registradas incluyeron pastoreo, rumiación, descanso, lactancia, caminata, vocalización (muu) y bebida según lo descrito18,19.

Las concentraciones de cortisol en plasma se determinaron en un solo ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ensayo ADVIA Centaur® Cortisol; Siemens Healthcare Pty Ltd, Bayswater, Victoria, Australia). La sensibilidad del ensayo fue de 2,0 ng/ml y el coeficiente de variación intraensayo fue del 3,5 %. Los NEFA también se determinaron en un único ensayo (Randox Australia Pty Ltd, Parramatta, Australia) utilizado previamente en bovinos20. La sensibilidad del ensayo fue de 0,03 mEq/l y el coeficiente de variación intraensayo fue del 1,4 %.

Los métodos de preparación y adquisición de muestras para 1H NMR se basaron en protocolos publicados21,22. Se dejó descongelar el plasma a temperatura ambiente y se mezcló una alícuota (350 µl) con 350 µl de solución tampón de fosfato acuosa (80 % H2O:20 % D2O) que incluía NaH2PO4 0,075 M, pH = 7,4 (KOH ajustado), sodio al 0,1 %. azida, 3-trimetilsilil-1-[2,2,3,3,-2H4] propionato (TSP) 1 mM en tubos Eppendorf. Las muestras se colocaron en un vórtice durante 30 s y luego se centrifugaron a 6000 × g durante 10 min. Se transfirieron alícuotas del sobrenadante (600 µl) a tubos de RMN de 5 mm para análisis de RMN de 1H.

Los espectros de RMN de 1H se adquirieron con un espectrómetro Bruker Avance III de 400 MHz que funciona a 400,13 MHz para 1H a 310 K equipado con una sonda de configuración inversa de banda ancha de 5 mm. Las muestras se analizaron en orden aleatorio y automatización con un sistema de automatización de muestras SampleCase 24. Las muestras se analizaron utilizando un espectro de RMN 1D con supresión de agua utilizando la secuencia de pulsos NOESYPRESAT (160 transitorios) y una secuencia de eco de espín Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) con presaturación (160 transitorios). La irradiación de la resonancia del disolvente (agua) se aplicó durante el retardo de presaturación (2,0 s) para todos los espectros y para los espectros de RMN 1D suprimidos con agua también durante el tiempo de mezcla (0,1 s). Los parámetros de la secuencia de pulsos, incluido el pulso de 90° (~ 12 µs), el desplazamiento de la frecuencia del pulso (~ 1880 Hz), la ganancia del receptor (90,5) y las potencias del pulso, se optimizaron en una muestra representativa y luego se establecieron constantes para la cohorte analizada. El ancho espectral fue de 30 ppm para experimentos NOESY y 20 ppm para experimentos CPMG. Los decaimientos de inducción de Fourier resultantes se procesaron con un ensanchamiento de línea exponencial de 0,3 Hz antes de la transformación de Fourier, que se recopilaron con aproximadamente 32 k puntos de datos reales.

Los conjuntos de datos sin procesar de 1H NMR se escalonaron automáticamente, se corrigió la línea de base y se hizo referencia al doblete de glucosa α-C1H (5,23 ppm) utilizando el software MATLAB 7.0 (MathWorks, Natick, MA). Para reducir la variación analítica entre muestras, la señal de agua residual (4,67–4,98 ppm) se truncó del conjunto de datos. La normalización del cociente probabilístico se realizó en toda la cohorte23. La asignación de metabolitos endógenos se realizó con un nivel de confianza alto utilizando Chenomx® (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Canadá) y por referencia a literatura publicada, recursos en línea y experimentos de adición24,25,26. Se utilizó el Reacoplamiento estadístico de variables27 para agrupar datos de espectro de RMN preprocesados en características o picos que representan la abundancia relativa de metabolitos.

Tras el procesamiento de los datos de RMN de 1H, se realizó un análisis estadístico multivariable utilizando MATLAB 7.0 y SAS (SAS Inc, Cary, NC). Los datos de comportamiento, ADG, cortisol, NEFA y la abundancia relativa de los metabolitos identificados se analizaron mediante un modelo de regresión lineal de efectos mixtos con el tratamiento como efecto fijo, el tiempo como medida repetida sujeta al efecto aleatorio de la pantorrilla y el tratamiento × tiempo interacción. El sexo se incluyó originalmente en el modelo con la interacción respectiva, pero resultó ser insignificante (P > 0,05) y, por lo tanto, se eliminó del modelo. La estructura de covarianza de potencia espacial se seleccionó en función del criterio de información bayesiano más bajo, que explica la distancia desigual entre medidas repetidas. Todas las variables y residuos fueron probados por normalidad, distribución aleatoria y media de cero. Los datos de cortisol y NEFA se transformaron a log10 antes del análisis para normalizar la distribución. Los datos de comportamiento se usaron para calcular el porcentaje de observaciones de cada comportamiento para cada animal y día, y luego los datos se transformaron usando la raíz cuadrada del arcoseno antes del análisis estadístico. Las diferencias entre las medias de los tratamientos se calcularon dentro de cada punto en el tiempo mediante comparaciones por pares.

Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) en los espectros normalizados para identificar posibles espectros inusuales (valores atípicos) y detectar patrones o tendencias evidentes en los perfiles de metabolitos28. No se detectaron valores atípicos y luego se realizó un segundo análisis PCA con la abundancia relativa de los 26 metabolitos identificados en cada punto de tiempo para detectar la agrupación de grupos de tratamientos después de trazar los componentes principales. Se utilizó análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) para discriminar animales entre los grupos de tratamiento (clasificación supervisada). Estos modelos OPLS-DA identifican espectros o abundancia de metabolitos que permiten asignar cada animal a un grupo de tratamiento en particular. Los modelos OPLS-DA generados se sometieron a 1000 pruebas de permutación de validación cruzada para evaluar la validez de los modelos supervisados28,29,30,31. Los modelos OPLS-DA se generaron a partir de los espectros normalizados de 1H NMR completos y de los 26 metabolitos identificados para determinar si un conjunto de datos era mejor para discriminar animales entre grupos de destete. La capacidad predictiva de los modelos OPLS-DA fue medida por el valor Q230.

No se encontraron diferencias significativas (P > 0.05; datos no mostrados) entre tratamientos en biomasa de pasto verde o seco al inicio (2130 ± 217 y 555 ± 67 kg MS, respectivamente) o al final (1753 ± 105 y 668 ± 47 kg MS , respectivamente) del juicio. El BW en el día 0 y el día 14 no difirió (P > 0.05) entre tratamientos (datos no mostrados). El ADG general fue mayor (P = 0,014) para los terneros NW (1,05 ± 0,079 kg/d) en comparación con los terneros W (0,74 ± 0,084 kg/d). La interacción tratamiento × día (P < 0.001) indicó que los terneros W perdieron peso entre el d 0 y el d 2 mientras que los terneros NW ganaron peso en este período (P = 0.06; Fig. 1). La GMD entre los días 2 y 7 fue mayor en los terneros W en comparación con los NW (P < 0,05) y se encontró el efecto contrario entre los días 7 y 14 (P < 0,05; Fig. 1). Todos los comportamientos mostraron una interacción tratamiento × día (P < 0.001; Fig. 2). Tanto los terneros W como los NW dedicaron una cantidad de tiempo similar a cada actividad en d − 2 y − 1 (P > 0,10). Por el contrario, los terneros W pasaron menos tiempo pastando en comparación con los terneros NW en el día 0 (P < 0,05), el día 1 (P = 0,06) y el día 7 (P < 0,05), pero más en el día 2 (P < 0,05). Los terneros W pasaron menos tiempo rumiando y más tiempo vocalizando y caminando en comparación con los terneros NW en los días 0, 1 y 2 (P < 0,05; Fig. 2). No hubo diferencias de comportamiento (P > 0,05) entre los terneros W y NW en el día 14, excepto por un menor tiempo de succión de las madres y una mayor caminata en W en comparación con los terneros NW, respectivamente (P < 0,05).

Tasa de crecimiento de terneros Angus destetados y no destetados. El destete fue el día 0. W es el efecto principal del destete; D es el efecto principal del Día relativo al destete. Los valores de †, *, **, *** dentro del día difieren o tienden a diferir entre los grupos de tratamiento (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Comportamiento de terneros de carne Angus destetados y no destetados en relación con el momento del destete (el día 0 fue después del destete). W es el efecto principal del destete; D es el efecto principal del Día relativo al destete. Los valores de †, *, **, *** dentro del día difieren entre los grupos de tratamiento (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Se observó una interacción destete × día para las concentraciones plasmáticas de cortisol (P < 0,05) y NEFA (P < 0,001; Fig. 3). Los terneros W tendieron a tener una mayor concentración de cortisol en los días 1 (P < 0,10) y 2 (P < 0,01) en comparación con los terneros NW, pero no se observaron diferencias entre los grupos en los días 7 y 14 (P > 0,10). Las concentraciones plasmáticas de NEFA fueron mayores (P < 0,01) en W en comparación con los terneros NW en los días 1, 2 y 7 (P < 0,05), sin diferencias en los días 0 y 14 (P > 0,10; Fig. 3) .

Concentración en sangre de cortisol y ácidos grasos no esterificados (NEFA) para terneros de carne Angus destetados y no destetados en relación con el momento del destete en el día 0 (muestra de sangre antes del destete). W es el efecto principal del destete; D es el efecto principal del Día relativo al destete. Los valores de †, *, **, *** dentro del día difieren entre los grupos de tratamiento (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Se identificaron un total de 26 metabolitos a partir de los espectros de RMN de 1H (Figs. 4, 5 y 6). La concentración relativa de metabolitos para los terneros NW no cambió con el tiempo (P > 0,05), mientras que todos los metabolitos cambiaron con el tiempo para los terneros W (P < 0,05). Las diferencias entre los terneros NW y W surgieron después del destete para 24 de los 26 metabolitos. Las excepciones fueron la histidina AA y la glutamina que no mostraron una interacción tratamiento x día (P > 0,05). Algunos metabolitos mostraron la mayor diferencia entre los grupos de destete en el día 1 y el día 2 y otros en el día 14 (Figs. 4, 5 y 6). Los terneros destetados tenían menor abundancia de tirosina y mayor abundancia de isoleucina en comparación con los terneros NW en el día 1 o el día 2 (P < 0,10) sin diferencias en el día 0, el día 7 y el día 14 (P > 0,10). La betaína fue mayor en los terneros W en comparación con los terneros NW en los días 2 y 7 (P < 0,05; Fig. 6). La abundancia relativa de otros metabolitos fue mayor para los terneros W en comparación con los NW solo en el día 7 o el día 14, o tanto en el día 7 como en el día 14, incluido un grupo de AA (valina, alanina, treonina, leucina, lisina, treonina), alantoína, acetato y glicoproteína; y menor abundancia en W en comparación con los terneros NW para VLDL/LDL y lípidos insaturados (P < 0.05). Otro grupo de metabolitos mostró una mayor abundancia relativa en W en comparación con los terneros NW desde el día 1 o el día 2 al día 14, incluidos fenilalanina, glutamato, creatinina, creatina, fosfato de creatina, glucosa, 3-hidroxibutirato y 3-hidroxiisobutirato (P < 0,10; Figuras 4, 5, 6).

Concentración relativa de metabolitos plasmáticos de terneros de carne Angus destetados y no destetados en relación con el momento del destete en el día 0 (muestra de sangre antes del destete). W es el efecto principal del destete; D es el efecto principal del Día relativo al destete. Los valores de †, *, **, *** dentro del día difieren entre los grupos de tratamiento (P ≤ 0,10, P ≤ 0,05, P ≤ 0,01, P ≤ 0,001).

Los gráficos de PCA no supervisados con los 26 metabolitos identificados como predictores en la Fig. 7 representan el primer componente principal (PC1, eje X) que representa la mayor parte posible de la variabilidad en los datos graficados contra el segundo componente principal (PC2, Y -eje). El PC2 representa la mayor variación posible en los datos bajo la restricción de que es ortogonal al componente anterior. La varianza explicada por los dos primeros PC fue superior al 50% para cualquier día en relación al destete (Fig. 7). Antes del destete (d 0), el PCA no mostró una discriminación obvia entre los terneros NW y W en función de sus metabolomas, como lo muestra la superposición de los dos grupos de terneros (Fig. 7A). En el día 1 después del destete, el PCA mostró una separación entre los terneros NW y W (Fig. 7B). Esta separación permaneció evidente en d 2 (Fig. 7C), d 7 (Fig. 7D) y d 14 (Fig. 7E).

Análisis de componentes principales de los espectros de RMN de 1H de terneros Angus no destetados (círculos abiertos) y destetados (círculos cerrados) (A) inmediatamente antes del destete abrupto, (B) d 1, (C) d 2, (D) d 7, y (E) d 14 después del destete. Las elipses sirven para resaltar la falta de agrupamiento en d 0 y el agrupamiento del grupo no destetado (contorno punteado) y el grupo destetado (contorno sólido) en diferentes días después del destete.

Un diagrama de dispersión OPLS-DA supervisado por múltiples vectores que utilizó el espectro completo de cada muestra también resaltó las diferencias en el metaboloma sanguíneo de los terneros según el tiempo y el estado del destete (Fig. 8). El metaboloma sanguíneo se alteró notablemente en el día 1 después del destete, que continuó hasta el día 14 después del destete. La creciente separación entre los terneros W y NW con el tiempo indicó que el metaboloma continuó divergiendo con el aumento del tiempo después del destete.

Estabilidad de los metabotipos de terneros Angus en relación con el tiempo y el grupo de tratamiento de destete (terneros destetados o no destetados). Gráfico de puntajes del modelo OPLS bidimensional (2 componentes predictivos y 5 ortogonales) derivados de espectros de 1H NMR del plasma de terneros Angus (punto de tiempo, azul oscuro a rojo) que no fueron destetados (círculos abiertos) y destetados (círculos cerrados) . Los puntos de tiempo son d 0 (púrpura), 1 (azul), 2 (verde), 7 (naranja) y 14 (rojo) después del destete.

Posteriormente, se crearon modelos discriminatorios separados para cada día de extracción de sangre y utilizando todo el espectro de RMN de 1H o los 26 metabolitos identificados (Tabla 1). En el día 0, el valor de Q2 indicó que el OPLS-DA no tenía validez predictiva de si los terneros pertenecían a los grupos NW o W (Tabla 1). Los valores de Q2 para los días 1 a 14 fueron > 0,40, lo que confirmó que OPLS-DA podía discriminar con precisión entre terneros NW y W utilizando tanto el espectro completo como la abundancia relativa de metabolitos (Tabla 1). Las predicciones que utilizan los metabolitos parecían funcionar ligeramente mejor que todo el espectro debido al Q2 ligeramente más alto. Las pruebas de permutación aleatoria confirmaron que todos los modelos podían diferenciar entre los grupos de tratamiento después del cambio en el estado de destete.

El presente estudio buscó caracterizar el efecto del destete abrupto en el metaboloma sanguíneo de los terneros de carne medido usando 1H NMR y respaldado por mediciones tradicionales de estrés y balance de energía como ADG, cortisol, NEFA y comportamiento. El PCA en cada fecha de muestreo se realizó para evaluar la posible agrupación de terneros en un grupo W o NW según el metaboloma como un método de clasificación no supervisado. Este análisis confirmó que el destete tuvo efectos importantes en la función metabólica para permitir la separación de grupos basada únicamente en el metaboloma sanguíneo. Estos resultados se confirmaron aún más mediante la clasificación supervisada (OPLS-DA), que mostró que se puede lograr una discriminación precisa utilizando todo el espectro de RMN o los metabolitos identificados. Además, tanto el análisis PCA como el OPLS-DA demostraron que el metaboloma de los terneros W y NW no difería antes del destete, pero existía una clara divergencia de grupos desde el momento del destete. Este es el primer estudio publicado para evaluar los cambios en el metaboloma sanguíneo de los terneros de carne después del destete según el conocimiento de los autores. Las diferencias en el metaboloma de la sangre entre los terneros NW y W no se explicaron por la biomasa total o verde del pasto disponible, que fue similar para los dos grupos. Por lo tanto, los cambios metabólicos observados en los terneros W probablemente se deban a una combinación de factores estresantes fisiológicos y psicológicos, el tipo de nutrientes consumidos y los cambios en la función metabólica como resultado de la interrupción del consumo de leche después de la separación física del ternero de la madre. cese de la lactancia, retirada del apoyo social de la madre y cambio de organización social2,4,32. Es importante señalar que los terneros del presente estudio tenían entre 5 y 6 meses de edad y se espera que el desarrollo del retículo-rumen se complete con el alimento sólido disponible a esta edad33. Sin embargo, los terneros aún amamantaban durante el presente estudio, lo que sugiere que una proporción de la energía y los nutrientes consumidos provenían de la leche de la madre. La leche consumida no pasa por el rumen para ser digerida en el abomaso y absorbida en el tracto gastrointestinal inferior33. La reducción en la concentración relativa plasmática de VLDL/LDL y lípidos insaturados en terneros W del día 0 al día 14 puede reflejar la reducción abrupta en el consumo de grasa de la leche y la dependencia del consumo de forraje. Los forrajes tienen muy bajo contenido de grasa (~ 1% de MS) mientras que la leche bovina tiene un alto contenido de grasa de aproximadamente 30% de MS33.

En contraste con la disminución a largo plazo de los lípidos, las marcadas diferencias entre los terneros W y NW durante la primera semana después del destete en el presente estudio podrían reflejar cambios fisiológicos de las hormonas del estrés. Investigaciones previas concluyeron que el estrés del destete era agudo y de corta duración (hasta 48 h) si las condiciones eran las adecuadas2. Los hallazgos del presente estudio para ADG, cortisol y comportamiento (vocalización, caminata y pastoreo) respaldan esta observación porque estas variables regresaron a los valores previos al destete en el día 7 de acuerdo con estudios previos19. El nivel elevado de cortisol en la sangre influye en una amplia gama de procesos fisiológicos en el ganado, incluido el metabolismo34,35 y la función inmunitaria5,6,36. En el presente estudio, la concentración de NEFA, betaína y 3-hidroxibutirato también alcanzó su punto máximo en el día 2 después del destete, pero permaneció elevada hasta los días 7 y 14, respectivamente. Por el contrario, el cortisol y los comportamientos indicativos de estrés ya habían regresado a los valores previos al destete en el día 7. Los niveles elevados de NEFA, betaína y 3-hidroxibutirato en el ganado generalmente reflejan un aumento en la lipólisis y la movilización de grasa corporal que puede ser causado por el estrés. glucocorticoides, alta demanda energética o balance energético negativo2,37. Los terneros W perdieron peso en el día 2 después del destete, sin embargo, tanto los terneros NW como los W aumentaron de peso a partir de entonces, lo que indica que no hubo un balance energético negativo. Por lo tanto, el hallazgo de que los terneros W tenían un ADG más bajo en comparación con los terneros NW sugiere un efecto mediado por el cortisol en la utilización de energía o un desafío nutricional por una menor ingesta de nutrientes, o ambos.

Las tendencias temporales en la abundancia de NEFA para los terneros W diferían notablemente de las de los lípidos, lo que sugiere que estos compuestos no comparten la misma ruta metabólica a pesar de que ambos forman parte del metabolismo de los lípidos. Esta especulación está respaldada por la falta de efecto del aumento de la concentración de grasa en el sustituto de leche sobre los NEFA y los triglicéridos en sangre de los terneros38. Además, no hubo correlación entre los NEFA y los lípidos en el presente estudio (P > 0,05; datos no mostrados). Por lo tanto, los lípidos medidos por RMN 1H pueden derivar de fuentes dietéticas, mientras que los NEFA pueden derivarse de la movilización de grasas.

La betaína es un donante de metilo que participa en el metabolismo de proteínas y lípidos, mejora la capacidad antioxidante para proteger las células del estrés y tiene propiedades osmorreguladoras en las células39. En vacas lecheras en transición, la producción de betaína aumentó bajo un balance energético negativo, lo que llevó a un aumento en la concentración plasmática de NEFA y 3-hidroxibutirato para respaldar la producción de energía a través de la lipólisis cuando la concentración de glucosa en plasma disminuyó40. Además, la suplementación con betaína durante los períodos de estrés por calor mejoró la producción de leche en el ganado lechero41,42 y el crecimiento y la deposición de grasa en el ganado de carne43,44. Se considera probable que los terneros W del presente estudio aumentaran la producción de betaína para mejorar la lipólisis y la oxidación de los triglicéridos y, por lo tanto, suministrar la energía necesaria para la respuesta al estrés del destete. Sin embargo, los hallazgos actuales difieren de las vacas lecheras lactantes porque los terneros no tenían un balance energético negativo y la concentración de glucosa aumentó en W en comparación con los terneros NW, a diferencia de las vacas lecheras en transición.

La abundancia relativa de tirosina disminuyó en los terneros W en los primeros 2 días después del destete en el presente estudio, lo que sugiere que la tirosina también desempeñó un papel importante en la respuesta al estrés del destete. La tirosina es un precursor de varios neurotransmisores de la vía de las catecolaminas implicados en la respuesta al estrés, incluidos la dopamina, la norepinefrina y la epinefrina45,46,47. Se plantea la hipótesis de que la respuesta de estrés agudo al destete aumentó la demanda y la utilización de tirosina, lo que llevó a una reducción de su concentración en la sangre. Sin embargo, la investigación sobre el papel de la tirosina en la respuesta al estrés del ganado es escasa y se requiere más investigación para sacar conclusiones más informadas.

Las glicoproteínas son proteínas de fase aguda que aumentan con la inflamación, la infección, el estrés y el trauma48. El aumento en la abundancia relativa de glicoproteína en los terneros W en comparación con los terneros NW puede haber reflejado la respuesta de estrés general de los terneros W al destete abrupto. Sin embargo, las proteínas de fase aguda generalmente no son específicas y no está claro si las glicoproteínas medidas por RMN son las mismas que las medidas por otras técnicas como ELISA o cromatografía. Sin embargo, estos hallazgos son importantes porque demuestran el potencial de la metabolómica sanguínea para medir múltiples metabolitos que indican diferentes respuestas y vías metabólicas.

En contraste con los metabolitos que parecían reflejar el estrés agudo del destete, otros metabolitos alcanzaron su mayor concentración relativa en el día 14, como valina, alanina, leucina, lisina, creatinina, creatina, fosfato de creatina, acetato y glucosa. Se sugiere que estos metabolitos reflejen un cambio en la función metabólica debido a cambios en la dieta, estrés crónico o ambos. El hecho de que no ocurrieran cambios significativos en el metaboloma de los terneros NW a lo largo del tiempo en el presente estudio sugiere que estos metabolitos reflejan ajustes metabólicos de los terneros W. Sin embargo, el presente estudio solo midió el metaboloma hasta 14 días después del destete y sería de interés medir los metabolitos durante un período más largo después del destete para determinar si estos cambios son el resultado de cambios metabólicos a largo plazo con el cese de la ingesta de leche o , alternativamente, ajustes metabólicos a corto plazo o una consecuencia de la respuesta de estrés agudo.

El aumento agudo y sostenido en la glucosa circulante de los terneros W en comparación con los terneros NW podría interpretarse como un reflejo de un aumento de la gluconeogénesis debido a la respuesta al estrés o a los ajustes metabólicos para producir más energía a partir de los ácidos grasos volátiles ruminales y AA gluconeogénicos en lugar de la leche, o ambos. Por un lado, los glucocorticoides promueven el metabolismo glucogénico durante el estrés a través de la movilización de las reservas de glucógeno en hígado y músculo45,49,50,51. Sin embargo, los comportamientos de cortisol y estrés alcanzaron su punto máximo en el día 2 después del destete y regresaron a los valores previos al destete en el día 7, mientras que la glucosa alcanzó su punto máximo en el día 14 en el presente estudio. Por otro lado, la tasa de gluconeogénesis aumenta con la transición de la etapa pre-rumiante a la rumiante1. Todos los terneros del presente estudio consumieron pasto de calidad media y, por lo tanto, se esperaba que la glucosa en la dieta fuera mínima. La gluconeogénesis en el hígado puede estar respaldada por propionato absorbido del rumen, lactosa, lactato y AA glucogénicos como alanina y glutamina1, y valina, isoleucina y treonina47. La alanina, la valina y la treonina parecían haber apoyado la gluconeogénesis en el presente estudio aumentando hasta el día 14 como la glucosa. No se identificó propionato en los espectros de RMN, aunque el acetato mostró un gran aumento en los días 7 y 14. Sin embargo, el lactato, la glutamina y la isoleucina no mostraron diferencias entre los terneros W y NW en los días 7 o 14.

El acetato es un AGV producido en mayor proporción durante la fermentación de dietas ricas en forrajes en el rumen donde es absorbido al torrente sanguíneo52. Por lo tanto, la mayor abundancia de acetato en los terneros W en comparación con los terneros NW en los días 7 y 14 podría deberse a un mayor consumo de forraje y fibra en los terneros W (en sustitución parcial de la leche). Después de la absorción, el acetato puede convertirse en 3-hidroxibutirato, oxidarse a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) o usarse para la síntesis de ácidos grasos53. Sin embargo, la concentración de acetato no alcanzó su punto máximo al mismo tiempo que el 3-hidroxibutirato en el presente estudio.

La tendencia temporal del 3-hidroxibutirato de los terneros W en el presente estudio fue interesante porque alcanzó su punto máximo en el día 2 pero permaneció elevado hasta el día 14. Este metabolito puede originarse ya sea por la oxidación incompleta de los ácidos grasos durante la lipólisis o por la conversión de acetato durante la absorción a partir de el rumen54. Por lo tanto, es posible que las tendencias observadas en los terneros W reflejen ambos procesos metabólicos, con una mayor abundancia de 3-hidroxibutirato durante los primeros 2 días después del destete reflejando la oxidación hepática incompleta de los ácidos grasos (NEFA) movilizados durante la respuesta al estrés agudo. La abundancia relativa de 3-hidroxibutirato podría entonces haber sido sostenida por la conversión del acetato absorbido en el rumen debido al aumento del consumo de forraje. Esto está respaldado por los resultados de estudios previos que demostraron que el 3-hidroxibutirato aumentó durante los períodos de alta demanda de energía o balance energético negativo en vacas lecheras o terneros posparto después del transporte y el destete37,55,56. Es importante tener en cuenta que la contribución relativa de diferentes vías metabólicas a las tendencias observadas y la abundancia de metabolitos circulantes no se puede medir con el diseño experimental del presente estudio. También es posible que otros metabolitos también reflejen la interacción entre múltiples vías metabólicas como la glucosa, la creatina, la fenilalanina, el glutamato y el 3-hidroxiisobutirato.

La creatina, el fosfato de creatina y la creatinina de los terneros W fueron máximamente diferentes a los de los terneros NW en el día 14. Estos metabolitos son críticos en el metabolismo energético del animal rumiante para almacenar y reciclar energía. Los niveles elevados de creatina quinasa, creatina y creatinina se asocian con una degradación muscular excesiva, daño muscular durante períodos de actividad física aumentada o desacostumbrada y estrés45,46,47. La creatina es una de las principales fuentes de energía para el tejido cerebral y el músculo esquelético durante la actividad física, que se convierte en fosfato de creatina mediante la enzima creatina quinasa y se almacena como una rica fuente de energía47. Esta reacción es reversible y, por lo tanto, el fosfato de creatina se puede convertir en creatina para producir energía (ATP), y la creatina luego se puede convertir en creatinina en una reacción irreversible que es un producto final inactivo del metabolismo muscular excretado en la orina47,57. Por esta razón, la creatinina a menudo se usa como indicador de la proteólisis y la masa muscular corporal, y normalmente disminuye en la sangre junto con aumentos de 3-hidroxibutirato y NEFA y con una reducción de la glucosa en vacas lecheras posparto que pierden peso corporal bajo un balance energético negativo58, 59. Sin embargo, estos cambios observados en vacas lecheras contrastan con los resultados en terneros destetados del presente estudio, donde los tres metabolitos aumentaron hasta el día 14 después del destete. Los terneros W del presente estudio mostraron un aumento de la actividad física inmediatamente después del destete en los días 1 y 2, pero disminuyó en los días 7 y 14, de acuerdo con estudios previos9,19. Por lo tanto, el aumento en la abundancia de creatina y creatinina de los terneros W hasta el día 14 parece no explicarse por la actividad física, los indicadores conductuales de estrés, el cortisol o los NEFA. Podría ser posible que la producción de creatina y el almacenamiento de fosfato de creatina continúen después de un período de estrés agudo o actividad física intensa que provoque una elevación "crónica" de estos metabolitos. Sin embargo, esta última hipótesis no se puede confirmar con los datos del presente estudio y se necesita más investigación para determinar si cambios tan profundos y a largo plazo en el metabolismo de la energía y las proteínas son el resultado de un estrés agudo anterior que resulta en una elevación crónica de la creatina y la creatinina o a los cambios metabólicos debido a la interrupción de la ingesta de leche. Independientemente, los terneros W parecían haber estado en una situación catabólica hasta el día 14 con proteólisis y lipólisis como se refleja en las altas concentraciones relativas de creatina, creatinina, 3-hidroxibutirato, glucosa y algo de AA.

La alantoína aumentó en los días 7 y 14 en W en comparación con los terneros NW en el presente estudio. La alantoína es uno de los derivados de la purina que aumenta con el flujo de proteína microbiana del rumen y con la ingesta de MO60, y también participa en el ciclo de la urea y se excreta en la orina47. Además, se ha sugerido que la alantoína es un biomarcador del estrés oxidativo crónico, la enfermedad y la senescencia tanto en el ganado como en los humanos61,62. El estrés crónico no fue evidente en el presente estudio, y se plantea la hipótesis de que la mayor concentración de alantoína de los terneros W en comparación con los terneros NW es el resultado de una mayor ingesta de alimentos sólidos y actividad microbiana ruminal después de la interrupción de la ingesta de leche. Sin embargo, el consumo de alimento no se midió en el presente estudio y, por lo tanto, se necesita más investigación para confirmar esta hipótesis. De manera similar, las razones del aumento sostenido de valina, alanina, treonina, leucina, lisina, fenilalanina y glutamato en terneros W hasta el día 14 son difíciles de explicar en el presente estudio porque no se midió la ingesta total de proteínas (tanto de la leche como del pasto) . La concentración de N fecal medida en los mismos días del muestreo de sangre como indicador de la ingesta de proteínas no mostró diferencias entre los terneros W y NW en ningún momento con un promedio general de 1,12 ± 0,033 y 1,15 ± 0,032 % de MS para los terneros W y NW, respectivamente (datos no mostrados; P > 0,05). Esto podría implicar que el flujo de proteína total al tracto gastrointestinal inferior no fue diferente entre los terneros W y NW.

Investigaciones previas que midieron los metabolitos en la sangre se realizaron en terneros alimentados con sustitutos de la leche que no experimentaron el estrés de la separación de la madre como en el presente estudio. Además, la asignación de leche se redujo gradualmente en la mayoría de los estudios previos con terneros lecheros63 y de carne64 y estos estudios se realizaron en corrales pequeños donde los animales no pueden expresar completamente sus comportamientos de estrés, como caminar largas distancias. Por ejemplo, la interrupción de la alimentación con sustituto de leche no mostró efectos sobre la glucosa o los NEFA en la sangre64,65, y aumentó la glucosa, el acetato, el propionato y el butirato, y disminuyó los NEFA63. Curiosamente, el 3-hidroxibutirato aumentó después del destete en todos los estudios anteriores y hay acuerdo en que este metabolito proviene de la conversión de acetato y butirato en el epitelio ruminal como resultado de una mayor ingesta de alimentos sólidos fermentados en el rumen de los terneros destetados63. Un estudio con terneros de carne a pie en el pasto que se colocaron en corrales al destete produjo resultados similares a los del presente estudio, donde tanto los NEFA como el 3-hidroxibutirato aumentaron después del destete, aunque la glucosa y la creatina quinasa no se vieron afectadas3 a diferencia del presente estudio. Es importante señalar que el último estudio no tuvo un grupo NW de control como el presente estudio. Una revisión de los efectos del destete en los terneros concluyó que la glucosa circulante produjo resultados inconsistentes entre los estudios, pero no se identificaron las causas de estas discrepancias2.

El presente estudio confirmó que la metabolómica de la sangre es una plataforma sólida para investigar y comprender los cambios metabólicos resultantes de interacciones complejas que surgen del estrés y los cambios en la dieta. La combinación de 1H RMN de alto rendimiento y estadísticas avanzadas es una poderosa combinación que genera una gran cantidad de información biológica. El campo de la metabolómica puede hacer una contribución importante para aumentar la comprensión de los cambios metabólicos complejos. Esto podría facilitar el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo, el rendimiento y el bienestar de los animales de producción. Por ejemplo, se podrían formular suplementos para terneros al destete con alta concentración de precursores de los metabolitos necesarios para la gluconeogénesis o la respuesta al estrés como la tirosina. Además, los requisitos nutricionales de los terneros destetados podrían gestionarse utilizando nuevas tecnologías para proporcionar cantidades y tipos específicos de suplementos66. Estos enfoques también se pueden integrar con estrategias que reducen la actividad física, como el destete en el jardín, el contacto en la cerca o el destete en dos etapas, que se sabe que reducen la respuesta al estrés y el gasto de energía8,9.

En conclusión, varios metabolitos clave mostraron cambios dramáticos en los terneros hasta el día 14 después del destete, lo que refleja cambios marcados en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas debido tanto al estrés como al cambio de dieta. Los cambios metabólicos debidos al estrés parecían de corta duración, siendo más marcados en el día 2 después del destete, mientras que los cambios metabólicos a más largo plazo se observaron hasta el día 14 después del destete. Los cambios drásticos a corto plazo en el metabolismo de los lípidos de los terneros W se reflejaron en un fuerte aumento de NEFA y betaína como donante de metilo para facilitar la oxidación de los lípidos. El metabolito 3-hidroxibutirato parecía estar involucrado en los cambios a corto y largo plazo en el metabolismo de los lípidos, alcanzando su punto máximo en el día 2 y permaneciendo alto hasta el día 14 después del destete. Los cambios a largo plazo en el metabolismo de los lípidos se mostraron a través de una menor concentración de LDL/VLDL y lípidos insaturados, que fueron más evidentes en el día 14 después del destete y podrían ser el resultado del cambio de dieta por la interrupción de la ingesta de leche. El cambio metabólico más importante asociado con el metabolismo de los carbohidratos fue el aumento significativo en la concentración de glucosa en plasma de los terneros W hasta el día 14, lo que podría deberse a un aumento de la gluconeogénesis. Además, un fuerte aumento en el acetato observado en los días 7 y 14 podría reflejar una mayor fermentación del alimento sólido en el rumen, lo que también puede haber contribuido a una alta abundancia sostenida de 3-hidroxibutirato en los terneros W. Los cambios en el metabolismo de las proteínas se evidenciaron a través de un aumento en varios AA y alantoína hasta el día 14. Finalmente, los cambios profundos a largo plazo en el metabolismo energético del músculo periférico y el tejido cerebral se reflejaron a través de un gran aumento en la concentración relativa de creatina circulante, creatina fosfato y creatinina en terneros W hasta el día 14. Se necesita más investigación para determinar si los cambios metabólicos a largo plazo de los terneros después del destete son un cambio permanente en el metabolismo o un cambio transitorio debido al estrés agudo o crónico, y si las concentraciones de metabolitos volver a los valores previos al destete.

Los datos están disponibles previa solicitud razonable al autor correspondiente.

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Agradecemos al Dr. Ian Luck por su asesoramiento experto en RMN 1H y al Sr. P. Lipscombe, la Sra. J. Lipscombe y la Sra. S. Steedman por el manejo y cuidado de los animales. También agradecemos al Dr. Augusto Imaz por la preparación de las cifras, al Sr. Allan Lisle por brindar asesoramiento estadístico y al profesor emérito Alan Bell por sus comentarios constructivos sobre una versión inicial del documento. JGSC contó con el apoyo del Programa Ciencia Sin Fronteras del CNPq (Brasil) y BCK contó con el apoyo de la Fundación CAPES (Ministerio de Educación de Brasil), el Prof. Luciano A. Gonzalez contó con el apoyo del McCaughey Memorial Trust y el legado de Nancy Roma Paech. El estudio fue financiado en parte por el legado de Nancy Roma Paech al Prof. Michael J. D'Occhio.

El estudio fue financiado por el legado de Nancy Roma Paech, McCaughey Memorial Trust y la Universidad de Sydney.

Instituto de Agricultura de Sydney y Escuela de Ciencias Ambientales y de la Vida, Facultad de Ciencias, Universidad de Sydney, Camden, NSW, 2570, Australia

Luciano A. González, Julia GS Carvalho, Bruno C. Kuinchtner y Michael J. D'Occhio

Departamento de Reproducción Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil

Julia GS Carvalho y Pietro S. Baruselli

Laboratorio de Ecología de Pastos Naturales (LEPAN), Universidad Federal de Santa María, Santa María, RS, Brasil

Bruno C. Kuinchtner

Instituto Kolling de Investigación Médica, Escuela de Medicina del Norte, Universidad de Sydney, St Leonards, NSW, 2065, Australia

Antonio C. Doña

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JGSC: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, redacción—borrador original; BCK, ACD, conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, redacción—revisión y edición; PSB: conceptualización, redacción—revisión y edición; MJD: conceptualización, metodología, obtención de fondos, investigación, metodología, administración de proyectos, recursos, supervisión, redacción—revisión y edición; LAG, conceptualización, curación de datos, análisis formal, metodología, supervisión, redacción—borrador original.

Correspondencia a Luciano A. González.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

González, LA, Carvalho, JGS, Kuinchtner, BC et al. La metabolómica del plasma revela cambios importantes en el metabolismo de los carbohidratos, los lípidos y las proteínas de los terneros de carne destetados abruptamente. Informe científico 13, 8176 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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Recibido: 07 Abril 2023

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 20 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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