microbioma integrado

Scientific Data volumen 10, Número de artículo: 280 (2023) Citar este artículo

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La deposición excesiva de grasa puede desencadenar enfermedades metabólicas, y es crucial identificar los factores que pueden romper el vínculo entre la deposición de grasa y las enfermedades metabólicas. Los cerdos Laiwu obesos sanos (LW) tienen un alto contenido de grasa pero son resistentes a las enfermedades metabólicas. En este estudio, comparamos el microbioma fecal, el metaboloma fecal y sanguíneo y el genoma de los cerdos LW y Lulai (LU) para identificar los factores que pueden bloquear el vínculo entre la deposición de grasa y las enfermedades metabólicas. Nuestros resultados muestran diferencias significativas en Spirochetes y Treponema, que están involucrados en el metabolismo de los carbohidratos, entre LW y LU. La composición del metaboloma fecal y sanguíneo fue similar, y algunos componentes de enfermedades antimetabólicas de los metabolitos sanguíneos fueron diferentes entre las dos razas de cerdos. El ARN diferencial predicho se enriquece principalmente en el metabolismo de los lípidos y el metabolismo de la glucosa, lo que es consistente con las funciones de la microbiota y los metabolitos diferenciales. El gen regulado a la baja RGP1 ​​está fuertemente correlacionado negativamente con Treponema. Nuestros datos ómicos proporcionarían recursos valiosos para futuras investigaciones científicas sobre la obesidad saludable tanto en humanos como en cerdos.

El depósito excesivo de grasa puede provocar daños crónicos en los órganos y enfermedades metabólicas1,2,3. Sin embargo, los factores genéticos por sí solos no pueden explicar completamente estas condiciones4. El papel de los factores metabólicos, como la microbiota intestinal y los metabolitos5,6,7,8, ha ganado cada vez más atención en la comprensión de las causas de las enfermedades metabólicas crónicas inducidas por la obesidad9,10,11. Se ha demostrado que los cambios en la composición de la microbiota intestinal desencadenan enfermedades metabólicas crónicas, como hipertensión, aterosclerosis y diabetes mellitus tipo 2 (T2DM)12,13,14. La microbiota produce metabolitos esenciales como el N-óxido de trimetilamina (TMAO) y está directamente relacionado con enfermedades metabólicas crónicas, como la aterosclerosis, la DM2, las enfermedades cardiovasculares (ECV) y los accidentes cerebrovasculares15,16,17,18. Además, la microbiota intestinal puede fermentar carbohidratos no absorbidos/no digeridos para producir ácidos orgánicos alifáticos como los ácidos grasos de cadena corta (AGCC)19,20. Los SCFA pueden proteger al huésped de la obesidad inducida por la dieta a través de los receptores acoplados a proteína G, y la microbiota regula indirectamente el metabolismo de los lípidos del huésped a través de los SCFA21,22,23. Por lo tanto, los microbios intestinales actúan como un órgano endocrino, produciendo metabolitos bioactivos que afectan la fisiología del huésped7,24,25,26. Por el contrario, estudios recientes han demostrado que el genoma del huésped puede influir en los fenotipos relacionados al alterar la microbiota intestinal. Por ejemplo, los genotipos ABO pueden influir en la estructura de la microbiota intestinal al regular la N-acetilgalactosamina (GalNAc)27. Por lo tanto, la integración del análisis ómico puede ayudar a identificar los factores clave que protegen a las personas contra las enfermedades metabólicas.

Los cerdos tienden a ser resistentes a enfermedades metabólicas como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), la DM2 y las enfermedades cardiovasculares a través de dietas ricas en grasas, fructosa y carbohidratos28,29. Este fenómeno es similar a la obesidad metabólica saludable (OMH) que son obesos pero protegen contra enfermedades metabólicas30. El cerdo demóstico chino Laiwu (LW) es conocido por su alto contenido de grasa, incluida la grasa subcutánea y la grasa intramuscular (IMF)31,32,33,34. En particular, el IMF de LW fue de hasta más del 7%, el promedio fue de hasta el 11,6% y el individuo más alto fue de hasta el 21%. LW se cruzó con el cerdo comercial occidental Yorkshire (YS) para criar el cerdo Lulai (LU) que tiene un 50 % de infiltración del gen LW35. El contenido de grasa de LU fue menor que el de LW, y el IMF fue de alrededor del 5%. En este estudio, elegimos ocho cerdos LW y ocho LU con dieta, higiene y condiciones ambientales similares para un manejo centralizado durante dos años (Tabla 1). Procesamos el microbioma fecal, el metaboloma fecal, el metaboloma sanguíneo y el genoma completo de los cerdos objetivo (como se muestra en la Fig. 1) para identificar los factores clave que protegen a las personas contra las enfermedades metabólicas a través del análisis de integración ómica.

Representación esquemática del flujo de trabajo para la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y el procesamiento de datos de microbioma-metaboloma-genoma.

En conclusión, nuestro estudio generó un conjunto de datos de alta calidad de metagenoma fecal, metaboloma fecal, metaboloma sanguíneo y secuencias del genoma completo de cerdos LW y LU. El metagenoma fecal produjo 34,5 gigabytes (Gb) y 35 Gb de lecturas sin ensamblar y reveló diferencias significativas en la abundancia de espiroquetas y treponemas, que están involucrados en el metabolismo de los carbohidratos. Identificamos un total de 1220 metabolitos en el metaboloma fecal y 713 metabolitos en el metaboloma sanguíneo, ambos ricos en ácidos grasos de cadena media y larga. El metaboloma sanguíneo contenía algunos componentes de enfermedades antimetabólicas, como ácidos grasos hidroxi, tanshinone IIA y betaína. El genoma completo obtuvo un promedio de 21,9 Gb de lecturas de extremos emparejados con un número total de 23,5 millones de polimorfismos de nucleótido único (SNP) de 18 autosomas. El análisis Fst (índice de fijación, estadística F de Wright) de SNP identificó 4 vías KEGG (enciclopedia de genes y genomas de Kioto), incluida la secreción de bilis y la digestión y absorción de grasas, que se enriquecieron en el 1% superior de Fst. El análisis de expresión de ARN de los tejidos adiposos de 16 cerdos identificó 412 genes expresados ​​diferencialmente, que se enriquecieron en 9 vías KEGG, incluido el metabolismo del almidón y la sacarosa y el metabolismo de los glicerofosfolípidos. La anotación funcional de los genes diferenciales mostró que el metabolismo de los lípidos y la glucosa fueron las principales funciones enriquecidas, en consonancia con las funciones de la microbiota y los metabolitos diferenciales. Además, se encontró que el gen RGP1 ​​regulado a la baja estaba fuertemente correlacionado negativamente con Treponema, lo que indica que la expresión de RGP1 ​​estaba estrechamente relacionada con el cambio en la abundancia de Treponema. En resumen, nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos sobre el papel de la microbiota intestinal, los metabolitos y la genética del huésped en el desarrollo de enfermedades metabólicas. La identificación de factores de enfermedades antiobesidad o antimetabólicas a través de la integración de datos microbiómicos-metabolómicos-genómicos tiene el potencial de conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para estas enfermedades.

Nuestro experimento fue diseñado para comparar ocho cerdos hembra Laiwu (LW) con ocho cerdos hembra Lulai (LU) que se cruzaron entre las razas LW y Yorkshire. Todos los cerdos nacieron y se criaron durante aproximadamente dos años (715 ± 33 días, Tabla 1) en condiciones uniformes de alojamiento y alimentación en la granja de cerdos Jing-Qi-Shen en la provincia de Jilin, China. La temperatura, la humedad y la luz variaron con las condiciones climáticas naturales. Se utilizaron lechones de diferentes madres y se eligió aleatoriamente un lechón por camada. Los lechones tenían edades similares, con los cerdos más viejos y más jóvenes del experimento separados por 66 días. Durante el período de lactancia, los lechones permanecían con su madre y luego eran trasladados a una pocilga con comederos automáticos. Los lechones fueron alimentados cinco veces al día, tres veces antes del apareamiento y una vez por la mañana y otra por la noche después del embarazo. Cuando las cerdas alcanzaron la madurez sexual, participaron en el apareamiento sexual y el parto normales. Las cerdas no estaban preñadas en el momento de la toma de muestras.

Los tiempos de defecación de los cerdos eran irregulares y la recolección de muestras osciló entre las 10 am y las 5 pm Se tomaron muestras de heces y sangre. Para mantener las muestras fecales libres de contaminación, usamos guantes estériles desechables limpios y capturamos el estiércol de cerdo antes de que toque el suelo. Las muestras fecales frescas se conservaron inmediatamente en tubos de recolección de muestras que se prepararon y se llenaron previamente con un agente protector de ADN bacteriano. Luego, las muestras fecales se colocaron en nitrógeno líquido para un enfriamiento rápido. Se recogieron dos tubos de muestras fecales de cada cerdo, uno para el perfil del microbioma y otro para el perfil del metaboloma. El mismo grupo de cerdos se sometió a un ayuno nocturno de 14 horas antes de la recolección de muestras de sangre. Se recogieron cinco mililitros de sangre de la vena yugular de cada cerdo usando una jeringa. La sangre fresca se conservó en un tubo de procoagulante de sangre y se colocó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la mezcla de sangre se centrifugó a 3000 g a 4 °C durante 10 minutos. El suero superior de sangre se transfirió a un tubo limpio de 1,5 ml. Todas las muestras de heces y sangre fueron etiquetadas y transportadas con hielo seco al laboratorio para su posterior procesamiento.

Utilizamos el kit de aislamiento de ADN EZNAsoil (OMEGA, Norcross, GA, EE. UU.) para extraer el ADN de la microbiota siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron absorbancia a densidad óptica (DO) de 1,8 a 2,0 y electroforesis en gel de agarosa al 1 % para evaluar la integridad y la calidad del ADN, y nuestra muestra de ADN cumplió con estos criterios. La secuencia de ADN completa se cortó en fragmentos cortos utilizando un sistema Covaris M220 (Qsonica, EE. UU.). Los fragmentos de 300 pb se construyeron en una biblioteca de extremos de pares (PE) utilizando un kit de preparación de muestras de ADN TruSeq™ (Illumina, San Diego, CA). La biblioteca de PE se evaluó con el kit Truseq PE cluster v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA) y la amplificación de los fragmentos de la biblioteca se realizó con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Utilizamos muestras de 1,5 μg para la secuenciación de próxima generación (NGS) en un Illumina NovaSeq. plataforma 6000.

Los datos de secuenciación NGS de salida se conservaron en formato fastq. Los datos sin procesar se verificaron para el control de calidad usando Trimmomatic36 (v0.39) y se procesaron usando los siguientes criterios: (a), si el valor de masa promedio era inferior a 20 dentro de la ventana deslizante de configuración de 50 pb, la cola de las lecturas de calidad de disconformidad era abandonado; (b), se abandonaron aquellas secuencias que contenían dos nucleótidos desconocidos (marcados con N); (c), se excluyeron las secuencias con contaminación del adaptador; ( d ), se excluyeron longitudes de secuencia inferiores a 50 pb y valores de masa de cola inferiores a 20. Después del recorte, quedaron secuencias de alta calidad. Para excluir aquellas secuencias obtenidas del genoma huésped, las secuencias restantes se asignaron al genoma de referencia de ADN porcino (Sscrofa 11.1), y se utilizó Burrows-Wheeler Aligner37 (v0.7.17) para eliminar las lecturas de alta similitud. Las secuencias restantes se ensamblaron de novo en contigs usando Megahit38 (v1.1.1). Finalmente, se predijeron los marcos de lectura abiertos (ORF) de los contigs ensamblados utilizando MetaGeneMark39 (v3.25). Las secuencias se agruparon usando CD-HIT40 con parámetros establecidos en 95 % de consistencia y 90 % de cobertura. Las secuencias más largas de cada grupo se seleccionaron para construir un catálogo de genes no redundantes. Luego, las secuencias de alta calidad restantes anteriores se compararon con el catálogo de genes no redundantes (establecido en 95% de identidad) utilizando SOAPaligner41, y obtuvimos un conjunto de genes y una abundancia de genes particulares. El conjunto de genes se comparó con la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes (base de datos NR) usando BLAST (v2.2.28) para obtener la anotación taxonómica y la abundancia (el valor e del parámetro de alineación se estableció como 1e-5). Finalmente, se analizaron las abundancias taxonómicas de los seis niveles de clasificación de reino, phylum, clase, orden, familia, género y especie.

Las muestras de heces y sangre se extrajeron y analizaron por separado. Antes del procesamiento de la muestra, preparamos preliminarmente 3 muestras de control de calidad (QC) que se mezclaron con muestras LW y LU en cantidades iguales. Luego, las muestras LW, LU y QC se separaron en 100 μl mezclándolas con 100 μl de agua preenfriada y 800 μl de metanol/acetonitrilo preenfriado (1:1, v/v). Las mezclas se colocaron en el baño de hielo y se sometieron a ultrasonidos durante 60 minutos. Para precipitar las proteínas, las mezclas se transfirieron a un refrigerador a -20 °C y se incubaron durante 1 hora. El sobrenadante se transfirió a tubos estériles limpios y se centrifugó a 16 000 g, 4 °C durante 20 minutos. A continuación, utilizamos una centrífuga de enriquecimiento al vacío de alta velocidad para secar el sobrenadante. El polvo seco se resuspendió añadiendo 100 μL de solución de acetonitrilo/agua (1:1, v/v), y esta solución se centrifugó a 16 000 g, 4 °C durante 15 minutos.

La separación cromatográfica se realizó mediante la plataforma de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) Agilent 1290 Infinity LC con espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadripolar (AB Sciex Triple TOF 5600) y columna HILIC (Agilent 1290 infinity). Las muestras de control de calidad que se utilizaron para evaluar la estabilidad del sistema y la confiabilidad de los datos se insertaron en la cola de muestras. La temperatura de la columna fue de 25 °C y la velocidad de flujo fue de 0,3 ml/min. Había dos fases móviles, la fase A contenía agua, acetato amónico 25 mM y agua amoniacal 25 mM, la fase B solo contenía acetonitrilo. El procedimiento de funcionamiento del sistema de fase móvil se estableció de la siguiente manera: 95% B a 0-0,5 min; 95% a 65% de B a los 0,5 a 7 min; 65% a 40% de B a los 7–9 min; 40% B mantenido en 9–10 min; 40% a 95% de B a los 10-11,1 min; 95% B mantenido en 11.1–16 min.

El modo de ion positivo o negativo de los componentes se detectó mediante ionización por electropulverización (ESI). La condición de la fuente ESI se estableció de la siguiente manera: fuente de iones gas1 (Gas1), 60 psi; fuente de iones gas2 (Gas2), 60 psi; cortina de gas (CUR), 30 psi; temperatura de la fuente, 600 °C; tensión flotante de iones de litio (ISVF), ±5500 V; Rango m/z de escaneo TOF MS, 60–1200 Da; rango m/z de barrido de iones de producto, 25–1200 Da; TOF MS scan tiempo de acumulación, 0,15 s/espectro; tiempo de acumulación de barrido de iones producto, 0,03 s/espectro. La espectrometría de masas secundaria se obtuvo usando adquisición dependiente de información (IDA) y se usó en modo de alta sensibilidad, potencial de desagrupamiento (DP), ±60 V; energía de colisión, 30 eV. IDA se estableció de la siguiente manera: excluir isótopos dentro de 4 Da; iones candidatos a monitorear por ciclo, 6.

ProteoWizard convirtió los datos de espectrometría de masas (MS) sin procesar en archivos mzXML. Se usó el programa XCMS en el software MSDIAL para la alineación de picos, la corrección del tiempo de retención y la extracción del área de picos. Para los datos extraídos, eliminó los picos de iones con valores perdidos > 50 % en el grupo. Luego se integraron los picos de iones positivos y negativos, y se utilizó el software SIMCA-P 14.1 (Umetrics, Umea, Suecia) para el reconocimiento de patrones. Se utilizaron coincidencias de masa precisas (<25 ppm) y coincidencias de espectro secundario para la identificación de estructuras de metabolitos, y se realizaron búsquedas en bases de datos como Human Metabolome Database (HMDB) y Massbank Database. Después de recuperar los metabolitos, los metabolitos se clasificaron utilizando el software de búsqueda MSDIAL. Los datos se normalizaron mediante escala de Pareto para su posterior análisis.

La extracción de ADN de la sangre se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del kit de preparación de muestras TruSeq DNA LT (Illumina, San Diego, CA). La calidad del ADN se evaluó midiendo la absorbancia a una DO de 1,6 a 1,8 con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.), mientras que la integridad del ADN se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Posteriormente, la secuencia de ADN se fragmentó en fragmentos de 350–450 pb utilizando Covaris M220. Los extremos de los fragmentos fueron reparados y fosforilados, seguido de la conexión del adaptador utilizando el kit NextFlexTM Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, EE. UU.). Finalmente, la biblioteca se amplificó mediante 15 ciclos de PCR para enriquecer pequeños fragmentos. La calidad y la concentración de la biblioteca se determinaron mediante Qubit (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.) y la secuenciación PE150 se realizó en Illumina NovaSeq. plataforma 6000.

Los datos de secuenciación se guardaron en formato fastq. Se utilizó Fastp42 (v0.20.0) con parámetros predeterminados para leer, filtrar y perfilar la calidad de las lecturas. Se usó BWA37 (v0.7.17) para mapear lecturas de alta calidad en el genoma de referencia del cerdo (Sscrofa11.1). Los archivos SAM fueron convertidos a archivos BAM por SamTools43 (v1.10). Las lecturas duplicadas se eliminaron con Sambamba44 (v0.7.1). La cobertura y la profundidad de los datos se calcularon utilizando Mosdepth45 (v0.2.9). Se utilizó GATK46 (v4.1.6) Haplotypecalle para procesar cada muestra y generar un GVCF intermedio, que se utilizó para el genotipado conjunto de todas las muestras en los GVCF de genotipo. Finalmente, los SNP se filtraron según los siguientes criterios: (1) QD < 2,0, FS > 60,0, MQ < 40,0, MQRankSum <−12,5, ReadPosRankSum <−8,0, SOR > 3,0; (2) frecuencia de alelos menores (MAF) < 0,01; (3) tasa de llamadas de variantes GATK < 0,9. El número de SNP obtenidos se muestra en la Tabla 4. La distribución de la densidad del genotipo se cartografió utilizando el paquete CMplot R. El análisis de componentes principales (PCA) se calculó utilizando Plink47 (v1.9). El análisis de la estructura genética de la población se realizó utilizando Admixture48 (v1.3.0). Los análisis de PCA y mezcla incluyeron los SNP de cerdos Yorkshire (YS), cerdos Duroc (DU) y cerdos Landrace (LR) que se obtuvieron de la base de datos PHARP49 (http://alphaindex.zju.edu.cn/PHARP/index.php) . El análisis FST se realizó con VCFtools50 (v0.1.13, –fst-window-size 50 000–fst-window-step 10 000. Window size 50 K, step size 10 K). La predicción de la expresión génica se realizó utilizando el servidor FarmGTEx TWAS51,52 (http://twas.farmgtex.org/). La anotación funcional para la ontología de genes (GO) y KEGG se realizó utilizando http://kobas.cbi.pku.edu.cn/.

El metagenoma fecal generó 34,5 Gb y 35 Gb de lecturas sin procesar sin ensamblar de muestras LW y LU, respectivamente. Después del control de calidad, la relación Q20 de la secuencia (bases con un valor de masa de 20 como porcentaje del número total de bases) superó el 96,99 % y la relación Q30 superó el 91,67 %, lo que indica que la calidad de los datos era adecuada para un análisis posterior. En promedio, se obtuvieron 5,5 millones y 5,7 millones de lecturas limpias de los conjuntos de datos LW y LU, respectivamente (Tabla 2). La diversidad intergrupal de las secuencias entre las dos razas porcinas se calculó utilizando el índice de diversidad de Shannon y Simpson, y no hubo una diferencia notable en las secuencias generales (Fig. 2C, D). El grupo LU se infiltró con el 50 % de los genes LW y se mantuvo en un entorno constante durante aproximadamente dos años, lo que puede explicar la composición microbiana indiscriminada de los dos grupos de cerdos. Las lecturas limpias se ensamblaron en contigs y se agruparon en base a una similitud del 95 % y una cobertura del 90 % para generar un catálogo de genes no redundantes que comprende un total de 4,2 millones de ORF con una longitud promedio de 622 pares de bases. La anotación de genes reveló que 262 645 genes eran exclusivos de LU y 350 102 genes eran exclusivos de LW (Fig. 2A). A pesar de tener más secuencias y contigs que LW, LU tenía menos genes anotados. En contraste con informes previos sobre recuentos de genes más bajos y diversidad bacteriana en individuos obesos53,54,55, nuestros resultados muestran que los cerdos más obesos tienen un recuento de genes más alto, lo que es contrario al hallazgo anterior. Las estadísticas de frecuencia acumulada de la abundancia de genes de las dos razas porcinas no mostraron diferencias significativas en la mayoría de los intervalos, pero los genes con un recuento de casi 40 fueron significativamente más abundantes en LW que en LU (Fig. 2B). Este hallazgo indica que las dos razas porcinas tienen composiciones diferentes, ubicadas principalmente en este intervalo.

Estadísticas de genes microbianos y comparación de diversidad entre LW y LU. (A) Estadísticas de genes. (B) Estadísticas de frecuencia acumulativa de genes. (C) Índice de diversidad de Shannon. (D). Índice de diversidad de Simpson.

El ambiente microbiano altamente similar de LW y LU puede atribuirse al alto grado de infiltración de genes y ambiente de crianza. Sin embargo, es probable que los microorganismos diferenciales restantes participen en la deposición de grasa, lo que genera diferencias en el contenido de grasa de las dos razas de cerdos. Por lo tanto, realizamos más análisis para identificar las diferencias microbianas entre LW y LU. Resumimos el microbioma en seis niveles de clasificación taxonómica, incluidos filo, clase, orden, familia, género y especie. En LW, detectamos un total de 146 filos, 90 clases, 323 órdenes, 304 familias, 2691 géneros y 14570 especies (Cuadro 3). Mientras tanto, LU mostró 145 filos, 90 clases, 321 órdenes, 306 familias, 2651 géneros y 14324 especies (Cuadro 3). Debido a anotaciones taxonómicas desconocidas a nivel de clase y familia, las estadísticas fueron más bajas. A nivel de clasificación de phylum, Firmicutes (66,94%), Bacteroidetes (17,93%) y Proteobacteria (5,69%) fueron los phyla predominantes, con Actinobacteria (2,38%), Spirochaetes (1,46%), Fibrobacteres (0,62%) y Planctomycetes ( 0.5%) también está presente en cantidades significativas (Fig. 3A, Tabla complementaria S5). La proporción total de Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria alcanzó el 91%, con la competencia de nicho más fuerte, ya que la proporción se estaba negociando (Tabla complementaria S1). A nivel de clasificación de género, los géneros predominantes fueron Clostridium (6,55%), Bacteroides (4,93%), Prevotella (7,15%), Streptococcus (4,2%), Oscillibacter (4,05%), Ruminococcus (3,39%), Faecalibacterium (1,8%). ) y Eubacterium (1,8%) (Fig. 3B, Tabla complementaria S2). Realizamos una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para analizar las diferencias entre los niveles taxonómicos de LW y LU entre el filo y el género. Los resultados revelaron una diferencia significativa en la abundancia de espiroquetas entre LW y LU en el nivel de clasificación del filo (Fig. 4A). Se ha informado que las espiroquetas están involucradas en el proceso metabólico de los carbohidratos56,57,58,59. A nivel taxonómico de género, hubo una diferencia significativa en la abundancia de Treponema entre LW y LU (Fig. 4B). Treponema es un género perteneciente a Spirochaetes.

Composición de la microbiota de alta abundancia en LW y LU. (A) Nivel de clasificación del Phylum. (B) Nivel de clasificación de género.

Microbiota diferencial a nivel taxonómico de filo y género en LW y LU. (A) Nivel de clasificación del Phylum. (B) Nivel de clasificación de género.

Los patrones de flujo de iones totales (TIC) de las muestras de control de calidad (QC) se compararon en modos de detección de iones positivos y negativos. La fuerza de respuesta y el tiempo de retención de cada pico cromatográfico se superpusieron, lo que indica que la variación causada por el error del instrumento es mínima y la calidad de los datos es confiable. Para el metaboloma fecal, extrajimos 12226 picos de iones positivos y 6891 picos de iones negativos, de los cuales se anotaron 703 picos de iones positivos y 517 picos de iones negativos. Los 1220 metabolitos anotados se clasificaron en 453 clases, incluidos triterpenoides, ácidos grasos de cadena larga y xantofilas, con 53, 19 y 13 tipos de metabolitos, respectivamente (Fig. 5A, Tabla complementaria S3). En el metaboloma sanguíneo, detectamos 5977 picos de iones positivos y 3081 picos de iones negativos, de los cuales se anotaron 368 picos de iones positivos y 345 picos de iones negativos. Los 713 metabolitos anotados se clasificaron en 360 clases, incluidos triterpenoides, alcaloides diterpenoides de tipo aconitano y alfa aminoácidos, con 15, 14 y 11 metabolitos, respectivamente (Fig. 5B, Tabla complementaria S4). Vale la pena señalar que los ácidos grasos de cadena larga y cadena media fueron los principales ácidos grasos en los metabolomas fecales y sanguíneos. Estos ácidos grasos se oxidan e hidrolizan fácilmente y pueden reducir los lípidos y el colesterol en la sangre, lo que puede estar relacionado con la menor susceptibilidad de los cerdos a las enfermedades metabólicas relacionadas con la obesidad. La composición del metaboloma fecal era similar a la del metaboloma de la sangre y contenía triterpenoides, xantofilas, ácidos grasos de cadena larga, ácidos grasos de cadena media, lípidos y alfa aminoácidos (Fig. 5A, B). La composición de los principales metabolitos de los dos metabolomas es muy similar y es probable que algunas de sus sustancias estén relacionadas.

Clasificación de los metabolitos del metaboloma fecal y sanguíneo. (A) Metabolitos del metaboloma fecal. (B) Metabolitos del metaboloma sanguíneo. El número de componentes del metabolito se clasifica en orden descendente. Los valores numéricos indican el número de metabolitos por clase.

Los metabolitos sanguíneos juegan un papel crucial en la regulación de la salud fisiológica, y comprender su influencia puede proporcionar información sobre cómo se protege a los cerdos de las enfermedades metabólicas. Para investigar esto, analizamos el metaboloma sanguíneo y medimos la intensidad de la influencia y la capacidad explicativa de los patrones de expresión de metabolitos utilizando la importancia variable para la proyección (VIP) obtenida a través de un modelo OPLS-DA. Seleccionamos metabolitos con VIP> 1 y Pvalue <0.05 (ANOVA unidireccional para comparación multigrupo) para identificar aquellos con diferencias significativas. Nuestros resultados revelaron 81 metabolitos que diferían significativamente entre los dos grupos porcinos (Tabla complementaria S5). De estos, 41 metabolitos fueron más abundantes en LW, incluidos angelicina, securinina, hipoxantina, betaína, citidina, homocisteína, curdiona, inosina, isopimpinellina, 5-metoxipsoraleno, palmitoilcarnitina, citrato, ácido esteárico, citarabina, licocalcona A y N-acetilneuramínico. ácido. Por otro lado, 40 metabolitos fueron más abundantes en LU, incluidos nitrazepam, acetaminofén, ácido icosanoico, gabapentina, espegatrina, ácido juárezico, dehidroefusol, gomisina H y ácido DL-2-hidroxivalérico. En particular, algunos de estos metabolitos sanguíneos cambiantes pueden estar relacionados con el contenido de grasa de los cerdos, ya que se ha demostrado que tienen efectos contra la adipogénesis y contra las enfermedades metabólicas crónicas. Por ejemplo, se ha informado que los ácidos grasos hidroxi muestran efectos antidiabéticos y antiinflamatorios60, y la tanshinona IIA se usa para tratar enfermedades cardiovasculares y tiene efectos contra la adipogénesis61,62,63. La betaína tiene propiedades anti-hígado graso y antiinflamatorias, lo que puede prevenir la hiperglucemia y reducir la resistencia a la insulina64,65,66.

Las muestras de LW y LU produjeron un promedio de 22 Gb y 21,9 Gb de lecturas emparejadas, respectivamente, de las cuales se obtuvieron 144,6 millones y 143,5 millones de lecturas limpias después del control de calidad. La calidad de los datos genómicos fue alta, con todas las proporciones Q20 de secuencia por encima del 95,69 % y proporciones Q30 por encima del 89,27 % (Tabla complementaria S6). La profundidad de secuenciación genómica promedio fue de 6,8 veces, con una cobertura que alcanzó el 97%, y se obtuvo un total de 22,7 millones de SNP (frecuencia de alelos menores ≥ 0,05) de 18 autosomas después del ensamblaje, llamada de SNP y filtrado de SNP (Tabla 4). La alta densidad de diversidad de nucleótidos en una ventana sin superposición de 1 mbyte (Mb) cubre todos los genomas (Fig. 6). Los análisis de mezcla y PCA revelaron diferencias claras en el pedigrí de LW y LU, con las razas de cerdo LW y LU bien distinguidas de la raza de cerdo Yorkshire (Fig. 7A, B). Además, se utilizó el método Fst para detectar las firmas de selección entre LW y LU. El valor máximo de Fst fue de hasta 0,8, lo que significa que su diferenciación de grupo es relativamente alta (Fig. 7C). El 1% superior de Fst se puede anotar en 811 genes (Tabla complementaria S7). Estos genes se anotaron mediante enriquecimiento funcional, lo que resultó en 6 vías GO y 4 vías KEGG, incluida la secreción de bilis y la digestión y absorción de grasas (Tabla complementaria S10). El análisis de expresión de ARN utilizando el servidor FarmGTEx TWAS predijo un total de 2930 genes en tejidos adiposos individuales en LW y LU, de los cuales 146 estaban regulados al alza y 266 estaban regulados a la baja (Tabla complementaria S8). Se anotaron las funciones diferenciales de los genes, lo que resultó en 6 vías GO y 9 vías KEGG, incluido el metabolismo del almidón y la sacarosa y el metabolismo de los glicerofosfolípidos (Tabla complementaria S10). Además, el análisis de correlación de Spearman identificó 42 genes fuertemente asociados con la microbiota diferencial Treponema a nivel taxonómico de género, incluidos 2 genes regulados al alza (ENSSSCG00000025565 y ENSSSCG00000049578) y 1 gen regulado a la baja RGP1 ​​(| Cor | > 0,6, Pvalue < 0,05, Tabla complementaria S9) .

Distribución de SNP en los cromosomas. El eje x muestra la posición cromosómica (en Mb) y el eje y representa los cromosomas. Los diferentes colores corresponden al número de SNP en cada bloque de genoma de 1 Mb.

Pedigrí y diferenciación de grupo entre LW y LU. (A) Resultados del análisis de componentes principales de las razas de cerdos LW, LU, YS, LR y DU. Los marcadores azul, naranja, rojo, violeta y verde representan cerdos LW, LU, YS, LR y DU, respectivamente. (B) Resultados de la composición de ascendencia con el número supuesto de ascendencia en K = 2. K es un parámetro ajustable que representa el número de posibles variedades ancestrales. Mediante el cálculo del error de validación cruzada, obtuvimos K = 2 como el mejor valor de K. (C) Diagrama de Manhattan basado en Fst de LW y LU.

Este estudio presenta cuatro conjuntos de datos distintos: metagenoma fecal, metaboloma fecal, metaboloma sanguíneo y genoma completo. Los datos sin procesar para el metagenoma y el genoma se almacenan en el archivo de lectura de secuencias NCBI en formato fastq. Hemos realizado un control de calidad preliminar y análisis estadísticos. Se proporcionan tablas complementarias que contienen proporciones taxonómicas.

Los archivos fastq sin procesar para los datos de secuenciación metagenómica están disponibles en la base de datos NCBI SRA en BioProject PRJNA74789367 (columna de acceso NCBI en la tabla complementaria S11), con el título del proyecto "Metagenomic Data of Laiwu Pigs and Lulai Pigs". Los archivos fastq sin procesar para los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) también están disponibles en la base de datos NCBI SRA en BioProject PRJNA74911568 (columna de acceso del NCBI en la tabla complementaria S12), con el título del proyecto "Datos de secuenciación del genoma completo de LW y LL".

Los archivos sin procesar de los datos del metaboloma fecal y del metaboloma sanguíneo se almacenan en la base de datos de MetaboLights69 con el identificador único del estudio MTBLS39776970. El título del proyecto es "Datos integrados del eje microbioma-metaboloma-genoma de los cerdos Laiwu y Lulai en China".

Realizamos un control de calidad y un análisis preliminar de los datos sin procesar de múltiples ómicas para facilitar una reutilización más rápida por parte de los académicos. Se puede acceder a los datos estadísticos preliminares a través de la información complementaria. Al mismo tiempo, el archivo adjunto de la versión de Excel se cargó en http://alphaindex.zju.edu.cn/ALPHADB/download.html. La información complementaria incluye:

Tabla S1: Relación de clasificación de Phylum para cada muestra.

Tabla S2: Relación de clasificación de género para cada muestra.

Tabla S3: Lista completa de metabolitos fecales para cerdos Laiwu y cerdos Lulai.

Tabla S4: Lista completa de metabolitos sanguíneos para cerdos Laiwu y cerdos Lulai.

Tabla S5: 81 metabolitos sanguíneos diferentes entre cerdos Laiwu y cerdos Lulai.

Tabla S6: información de datos limpios para todo el genoma.

Tabla S7: 811 genes anotados para el 1% superior de Fst.

Tabla S8: 2930 genes para tejidos adiposos predichos a partir de SNP utilizando el servidor FarmGTEx TWAS.

Tabla S9: Fuerte correlación entre los genes predichos y Treponema.

Tabla S10: Anotación de enriquecimiento funcional para Fst y RNA usando GO y KEGG.

Tabla S11: columna de acceso NCBI SRA para PRJNA747893.

Tabla S12: columna de acceso NCBI SRA para PRJNA749115.

Para garantizar la autenticidad de la muestra y evitar la contaminación durante el proceso de muestreo, se utilizaron guantes de PE desechables para recolectar muestras fecales inmediatamente después de la defecación de los cerdos objetivo. Luego, las muestras se transfirieron a tubos específicos de conservación de muestras fecales y sus identificaciones únicas de muestra se compararon con las identificaciones de secuenciación y extracción de ADN. La calidad del ADN se confirmó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 y electroforesis en gel de agarosa. La secuenciación de ADN de alta calidad se realizó con NovaSeq. Tecnología de secuenciación 6000. Los datos sin procesar obtenidos de la secuenciación metagenómica y del genoma completo se sometieron a control de calidad para obtener lecturas de alta calidad para su posterior análisis. Los valores de Q30 para los datos de secuenciación metagenómica sin procesar de 16 muestras oscilaron entre 91,65 % y 95,8 %. Después del control de calidad, los valores de Q30 oscilaron entre 91,67 % y 95,78 %. Para los datos sin procesar del genoma completo, el rango Q30 fue del 88,55 % al 90,45 %, mientras que el rango Q30 de lecturas limpias después del control de calidad fue del 89 % al 91 %. Para controlar la abundancia de genes metagenómicos, se utilizó la normalización de transcripciones por millón (TPM). Se impusieron y compararon el modo de corriente de iones totales (TIC) de las muestras de control de calidad en los modos de detección de iones positivos y negativos. La fuerza de respuesta y el tiempo de retención de cada pico cromatográfico coincidieron, lo que indica que el error del instrumento fue mínimo y que la calidad de los datos fue confiable.

Se puede acceder al software requerido para el procesamiento y análisis de datos y la generación de imágenes en este estudio, las versiones de software son las siguientes:

1. Trimmomatic (v0.39, http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)

2. BWA (v0.7.17, http://bio-bwa.sourceforge.net)

3. Megaéxito (http://i.cs.hku.hk/~alse/hkubrg/projects/idba_ud/)

4. MetaGeneMark (v3.25, http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi)

5. CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)

6. SOAPaligner (http://soap.genomics.org.cn/)

7. BLASTP (BLAST v2.2.28+, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

8. MSDIAL (v4.7, http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html)

9. SIMCA-P (v14.1)

10. Fastp (v0.20.0, http://opengene.org/fastp/fastp)

11. Samtools (v1.10)

12. Paralelo (v0.7.1)

13. Mosprofundidad (v0.2.9)

14. Herramientas Picard (v2.0.1)

15. Bcftools (v1.939)

16. GATK (v4.1.6)

17. Plink (v1.9, índice de bandera completo - PLINK 1.9 (cog-genomics.org))

18. Mezcla (v 1.3.0)

19. Herramientas VCF (v0.1.13)

20. Servidor TWAS de FarmGTEx (http://twas.farmgtex.org/)

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFD1200802), el Programa Provincial de Investigación y Desarrollo Clave de Shandong de China (2021LZGC001), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Número de subvención: U21A20249, 32272833) y el Programa Provincial de Investigación y Desarrollo Clave de Zhejiang de China (2021C02008).

Departamento de Ciencia Animal, Facultad de Agricultura y Biología, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, República Popular China

Xueshuang Lai, Qamar Raza Qadri y Yifei Fang

Departamento de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Animales, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310030, PR China

Xueshuang Lai, Zhenyang Zhang, Zhe Zhang, Shengqiang Liu, Zitao Chen, Yifei Fang, Zhen Wang, Yuchun Pan y Qishan Wang

Instituto de Hainan, Universidad de Zhejiang, Sanya, 310014, República Popular China

Shengqiang Liu, Yuchun Pan y Qishan Wang

Departamento de Ciencias Animales, Facultad de Ciencias Animales, Universidad de Jilin, Changchui, 130015, PR China

chunyan bai

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Yuchun Pan y Qishan Wang concibieron y diseñaron este estudio. Xueshuang Lai escribió el manuscrito. Zitao Chen y Chunyan Bai recolectaron las muestras. Xueshuang Lai y Zhenyang Zhang construyeron las bibliotecas de ADN. Xueshuang Lai, Zhenyang Zhang, Zhe Zhang, Shengqiang Liu y Zhen Wang llevó a cabo el análisis de datos. Qishan Wang, Zhe Zhang, Qamar Raza Qadri y Yifei Fang editaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yuchun Pan o Qishan Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lai, X., Zhang, Z., Zhang, Z. et al. Datos integrados del eje microbioma-metaboloma-genoma de cerdos Laiwu y Lulai. Datos científicos 10, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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Recibido: 13 Septiembre 2022

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 13 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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