Expresión diferencial y regulación del gen HSP70 durante la fase de crecimiento en rumiantes en respuesta al estrés por calor

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18310 (2022) Citar este artículo

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Las proteínas de choque térmico regulan el mecanismo fisiológico de adaptación al estrés por calor a nivel celular. La presente investigación se llevó a cabo para analizar la regulación del gen HSP70 en diversas etapas de crecimiento en rumiantes en células mononucleares de sangre periférica (PBMC). No se ha analizado la relación entre la expresión del gen HSP y la termotolerancia en función de la edad en rumiantes. Por lo tanto, se examinó el nivel de expresión de m-RNA HSP70 en diferentes grupos de edad de cabras Jamunpari durante condiciones climáticas cálidas. El experimento se llevó a cabo en 32 animales de cabra Jamunapari pertenecientes a los grupos de edad de 3 meses, 9 meses, 12 meses y adultos (2-3 años). El ARN total se aisló de células mononucleares de sangre periférica. La respuesta fisiológica como la temperatura rectal (RT), la frecuencia respiratoria (RR) y la frecuencia cardíaca (FC) se utilizó como indicador de estrés por calor. Se utilizó el índice de temperatura y humedad (THI) como indicador de la gravedad del estrés ambiental. El rango de THI varió de 82,00 a 92,08 durante el período experimental. El nivel de expresión de m-RNA HSP70 a los 9 meses de edad de los animales estaba regulado al alza y era significativamente más alto que en otros grupos de edad. Se observó que el nivel de transcripciones de HSP70 en PBMC era más alto en el grupo de edad de 9 meses, y se observó una disminución relacionada con la edad en la expresión de HSP70 en la edad adulta. Según la respuesta fisiológica, los fenotipos contrastantes de estrés por calor se reconocieron como individuos susceptibles al estrés por calor (HSS) y tolerantes al estrés por calor (HST) y se analizó la expresión de m-RNA HSP70 a diferentes edades en respuesta al estrés por calor crónico. La expresión diferencial de ARNm de los individuos HSS a los 3 y 9 meses de edad mostró la expresión más alta que la HST. La edad y el fenotipo tuvieron un efecto significativo (p < 0,01) sobre el valor del punto de cruce (PC). La expresión del gen m-RNA HSP70 en diferentes grupos de edad se correlacionó con la tolerancia al estrés por calor y esto podría usarse como biomarcador para que los criadores analicen la respuesta de HSP in vivo en rumiantes.

La aclimatación térmica y la adaptación térmica están asociadas con un mayor nivel basal de proteínas de choque térmico (HSP)1,2. Las HSP se activan en respuesta a diversos factores estresantes ambientales y de otro tipo. Se ha observado que el epitelio de la piel libera proteínas de choque térmico para movilizar el choque térmico en respuesta al estrés por calor. La expresión de HSP70 inducible aumenta varias veces a medida que la temperatura de la piel se acerca al límite superior de la zona termoneutral de los rumiantes. La vía de regulación del estrés por calor protege el proteoma de todas las células en respuesta a temperaturas elevadas y al daño oxidativo3,4. A nivel celular, el calor y otros estresores metabólicos inducen las HSP y aumentan la expresión génica debido a la activación de los factores de transcripción de choque térmico (HSF)5,6,7. Las HSP interactúan con otras proteínas celulares durante condiciones de estrés y mantienen la homeostasis celular8. Los animales individuales responden al estrés fisiológico y ambiental activando diferentes vías de regulación del estrés que protegen los procesos biológicos centrales al promover el plegamiento de proteínas. Las HSP se liberan intracelular y extracelularmente de forma inducible en respuesta al estrés. La tolerancia celular al estrés por calor está regulada por las HSP y HSP70 puede ser un indicador de estrés en las células9. Las HSP son las encargadas de mantener el equilibrio entre la supervivencia y un sistema inmunitario eficaz en el organismo para aclimatarlo al estrés10.

La capacidad de soportar el estrés por calor es un componente importante de la condición física de los adultos. Las células liberan proteínas de choque térmico en respuesta a estrés metabólico o ambiental8. Se ha observado que hubo una disminución en la expresión inducida por calor de HSP 70 m-RNA en fibroblastos primarios de rata con el envejecimiento11. De manera similar, se ha notificado la disminución de la expresión de HSP70 inducida por calor en fibroblastos diploides humanos en función del paso celular (envejecimiento in vitro). La termorregulación dependiente de la edad a nivel fisiológico se ha observado tanto en humanos como en animales de experimentación12. También se ha demostrado que la HSP regula la tolerancia al estrés a nivel tisular in vivo13. Por lo tanto, el presente estudio se llevó a cabo para analizar la expresión de m-RNA HSP70 relacionada con la edad en respuesta al estrés por calor en rumiantes. El estudio se llevó a cabo in vivo para observar el mecanismo de termorregulación en animales de hasta 1 año de edad e individuos adultos durante el período de estrés por calor. Se analizó la expresión de ARNm de HSP 70 durante la fase de crecimiento de rumiantes hasta la edad de madurez y en animales adultos en respuesta al estrés por calor. La regulación de la expresión de HSP70 con respecto al proceso de envejecimiento in vivo no se ha llevado a cabo en rumiantes. La expresión diferencial de la proteína HSP70 aún no se analiza ni comprende en rumiantes, por lo que el presente estudio analiza el patrón de expresión de la proteína de choque térmico a diferentes edades durante el período de estrés por calor.

La temperatura ambiental durante el período experimental varió de 40 a 49.5 °C. El índice de temperatura y humedad (THI) varió de 82,0 a 92,08 durante el período cálido. La respuesta fisiológica como la temperatura rectal (RT), la frecuencia respiratoria (RR) y la frecuencia cardíaca (FC) exhibieron una amplia variabilidad en los animales durante el período de estrés por calor y se presentan en la Tabla 1. El rango de variabilidad en RT, RR y HR fue de 38,1 a 39,9 °C, 24 a 84 respiraciones/min y 100 a 160 latidos/min durante el período caliente, respectivamente (Tabla 1). La clasificación de las diferencias fenotípicas a nivel de población se basó en los datos presentados anteriormente. Sobre la base de la distribución de RR y HR, los individuos que tenían un RR de ≤ 34 (respiraciones/min) y una HR de ≤ 108 (latidos/min) fueron reconocidos como fenotipo tolerante al estrés por calor (HST). Sin embargo, una FR de ≥ 50 (respiraciones/min) y una FC de ≥ 130 (latidos/min) se reconocieron como fenotipo susceptible al estrés por calor (HSS). La variación media de las respuestas fisiológicas durante el período de estrés por calor extremo con respecto al fenotipo susceptible al estrés se presenta en la Tabla 2 y la Fig. 1 complementaria. La media de RT, RR y HR mostró una variación significativa dentro del fenotipo susceptible y tolerante al estrés por calor. La media de RT, RR y HR del fenotipo sensible al calor fue de 39,277 °C, 70,923 respiraciones/min y 145,538 latidos/min, respectivamente. La media del fenotipo susceptible y tolerante al estrés por calor difirió en 0,859 °C en RT, 39,650 respiraciones/min en RR y 37,083 latidos/min en FC, respectivamente. La variación media de las respuestas fisiológicas en diferentes edades con respecto al fenotipo de estrés HSS y HST se presenta en la Tabla 3. El RT, RR y HR fueron significativamente diferentes (P < 0.01) entre los fenotipos HSS y HST en diferentes grupos de edad. Por lo tanto, RT, RR y HR se vieron afectados significativamente (P < 0,01) por la edad de los animales.

Se analizó el nivel relativo de expresión de m-RNA de HSP70 en los diferentes grupos de edad de cabras Jamunapari durante el período cálido. El patrón de expresión de m-RNA de HSP70 se analizó a los 3, 9, 12 meses de edad y en adultos (2-3 años) con respecto a los fenotipos de estrés. Los genes de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y beta actina (β-actina) se utilizaron como control interno. La calidad del producto amplificado mediante el uso de RT-PCR (Fig. 2 complementaria), la curva de amplificación y el pico de fusión se proporcionan en la Fig. 3A y la Fig. 3B complementarias. El patrón relativo de expresión de ARNm del gen HSP70 en edades de 3, 9, 12 meses y adultos mostró una regulación positiva de 5,70, 23,90, 4,08 y 1,51 en comparación con el control adulto (susceptible al estrés por calor) (Tabla 4 y Fig. 1). La expresión de ARNm fue significativamente mayor a los 9 meses de edad de los animales en comparación con otros grupos de edad. La expresión del gen HSP70 a los 9 meses de edad de las cabras Jamunapari fue 23,9 veces mayor en comparación con el calibrador (grupo de control). Además, los 9 meses de edad mostraron un nivel de m-RNA 5,86 veces y 15,83 veces mayor que los 12 meses de edad y el adulto, respectivamente (Tabla 4 y Fig. 1).

Expresión relativa de ARNm (cambio de pliegue) del gen HSP70 en diferentes grupos de edad de cabra Jamunapari. 3 M, 3 meses de edad del animal; 9 M, 9 meses de edad del animal; 12 M, 12 meses de edad del animal; adulto, 2–3 años de edad de los animales. Las lecturas del punto de cruce (Cp) para cada muestra desconocida se usaron luego para calcular la cantidad del gen objetivo o del gen doméstico usando el método máximo de la segunda derivada con el software de análisis Light Cycler 480 versión 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, EE. UU. ). Se usaron GADPH y β-actina para normalizar la expresión génica. El individuo susceptible se utilizó como calibrador positivo para obtener la expresión génica normalizada.

Sin embargo, la expresión diferencial de m-RNA entre los fenotipos contrastantes susceptibles y tolerantes al estrés por calor indicó que los individuos con SSH a los 3, 9, 12 meses y adultos exhibieron una expresión 3,57, 32,34, 3,70 y 0,54 veces mayor que el control. De manera similar, los individuos HST a los 3, 9, 12 meses y adultos exhibieron una expresión 3,20, 17,66, 4,50 y 4,41 veces mayor que el control. La expresión de ARNm del gen HSP70 basada en los fenotipos de estrés por calor fue 3,57 y 32,34 veces mayor en el fenotipo susceptible al estrés por calor a los 3 y 9 meses de edad de los animales, respectivamente. De manera similar, el fenotipo tolerante al estrés por calor exhibió una expresión 3,20 y 17,66 veces menor a los 3 y 9 meses de edad durante el período caluroso (Tabla 5 y Fig. 2).

Expresión relativa de ARNm (cambio de pliegue) del gen HSP70 en diferentes grupos de edad de cabra Jamunapari con respecto al fenotipo HST y HSS. 3 M-HST, 3 meses de edad del animal: fenotipo tolerante al estrés por calor; 3 M-HSS, 3 meses de edad del animal: fenotipo susceptible al estrés por calor; 9 M-HST, 9 meses de edad del animal: fenotipo tolerante al estrés por calor; 9 M-HSS, 9 meses de edad del animal: fenotipo susceptible al estrés por calor; 12 M-HST, 12 meses de edad del animal: fenotipo tolerante al estrés por calor; 12 M-HSS, 12 meses de edad del animal: fenotipo susceptible al estrés por calor; Adulto-HST, Adulto (2–3 años) edad del animal- Fenotipo tolerante al estrés por calor; Adulto-HSS, Adulto 92–3 años) edad del animal- Fenotipo susceptible al estrés por calor. Las lecturas del punto de cruce (Cp) para cada muestra desconocida se usaron luego para calcular la cantidad del gen objetivo o del gen doméstico usando el método máximo de la segunda derivada con el software de análisis Light Cycler 480 versión 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, EE. UU. ). Se usaron GADPH y β-actina para normalizar la expresión génica. El individuo susceptible se utilizó como calibrador positivo para obtener la expresión génica normalizada.

Se analizó la media de mínimos cuadrados del valor del punto de cruce (CP) en los diferentes grupos de edad de cabras Jamunapari. La Tabla 6 muestra el efecto de la época de nacimiento, tipo de nacimiento, sexo, edad, fenotipo y paridad. El fenotipo HSS mostró una CP significativamente mayor (p < 0,01) que el fenotipo HST. La interacción sexo por fenotipo mostró una diferencia significativa (p < 0.01) en CP (Cuadro 7). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la temporada de nacimiento, el tipo de nacimiento y el sexo en CP. La tabla ANOVA reveló que la edad, el fenotipo y la paridad tuvieron un efecto significativo (p < 0,01) sobre la CP (Tabla 8). De manera similar, la estación de nacimiento, el tipo de nacimiento, la edad y la paridad tuvieron un efecto significativo (p < 0,01) sobre el peso corporal.

HSP 70 juega un papel protector durante el estrés por calor y también regula el crecimiento y la proliferación celular normal. Las HSP protegen a las células contra la apoptosis mediada por el estrés oxidativo24. La tolerancia al estrés térmico celular está regulada por HSP25,26,27 y HSP70 se considera un marcador de tolerancia al estrés por calor en diferentes especies28,29. La regulación del estrés por calor relacionado con la edad y la tolerancia térmica en condiciones ambientales cálidas en el ganado no se han entendido bien. El patrón de expresión de m-RNA de HSP70 mostró que la expresión del gen HSP70 fue significativamente mayor a los 9 meses de edad en comparación con los 12 meses y la edad adulta en cabras Jamunapari. La expresión de m-RNA HSP70 fue aproximadamente 5,85 y 15,75 veces mayor en comparación con los 12 meses y la edad adulta. El nivel de expresión del gen m-RNA HSP70 en edades de 3, 9, 12 meses y adultos mostró una regulación positiva de 5,70, 23,90, 4,082 y 1,51 en comparación con el control adulto (individuos susceptibles al estrés por calor). El crecimiento y desarrollo de las cabras ocurre de manera similar en comparación con otros rumiantes y mamíferos. El crecimiento está en función del ciclo de vida de cada animal que comienza con la fecundación del embrión y termina con la muerte. Las células son la unidad básica de crecimiento y desarrollo. Las tasas de crecimiento y desarrollo se rigen tanto por el potencial genético como por factores ambientales. La fase fetal de crecimiento es desde la diferenciación hasta el parto. Los factores que afectan el crecimiento y desarrollo posnatal son el potencial genético y la influencia del medio ambiente y la nutrición para lograr la composición genética. Las cabras alcanzan la madurez a los 9 meses de edad y es la edad de maduración del sistema inmunológico. Como es evidente la inmunidad materna afecta al individuo hasta los 6 meses de edad. Por lo tanto, 9 meses es la edad para seleccionar individuos por crecimiento y otros rasgos económicos. La madurez sexual es la edad en que los mamíferos pueden reproducirse y alcanzan el desarrollo en todas las fases. La familia de roedores alcanza la madurez sexual a la edad de 1 a 2 meses, la familia de perros y bóvidos alcanza la madurez sexual alrededor de 1 año de edad y los primates, incluido el ser humano, alcanzan la madurez a la edad de 23 años30. El crecimiento y el desarrollo están determinados por múltiples factores únicos e interactivos de los entornos externo e interno. Se requiere entender el crecimiento y desarrollo en caprinos y los factores que inciden en estos procesos ya que determina la eficiencia de la producción y la calidad del producto. La tasa y la eficiencia del crecimiento y los efectos posteriores sobre la calidad del producto deben manipularse desde la concepción hasta el consumo para mejorar la salud humana y una gestión eficaz de los recursos31. La exploración de los patrones de expresión y su relevancia en la supervivencia y la adaptación es una gran promesa en la mejora del ganado y los regímenes de reproducción.

De manera similar, la expresión de ARNm de HSP70 a los 3, 9, 12 y adultos fue de 3,57, 32,34, 3,70 y 0,54 veces en el fenotipo HSS y de 3,20, 17,66, 4,50 y 4,41 veces en el fenotipo HST, respectivamente. La expresión diferencial de m-RNA indicó que los individuos HSS a los 3 y 9 meses de edad tenían la mayor expresión de veces que HST. De manera similar, el estudio del perfil de expresión del gen m-RNA para HSP60 y HSP70 también se ha informado en cabras Saanen32. Además, se observó una correlación significativamente positiva de HSP70 y 60 entre la condición ambiental y los parámetros fisiológicos en cabras lecheras33. Se ha informado que el perfil estacional de las concentraciones de HSP60 y 70 es menor en la temporada de invierno en comparación con el verano y se encontró una correlación positiva y significativa entre la concentración de HSP y los datos fisiológicos en cabras34. En este estudio, los animales de 1 a 2 años (grupo más joven) mostraron el mayor aumento en la expresión de HSP en comparación con los animales de 3 a 4 años y de 5 a 6 años. Además, también se registró una variación estacional con el nivel de HSP70 con una expresión elevada de HSP60 y HSP70 durante el verano en comparación con otras estaciones. Estos hallazgos también son consistentes con los mamíferos más pequeños, especialmente los roedores, como las ratas Wistar macho11. Se ha establecido que hubo una disminución en la expresión de ARNm de HSP70 inducida por calor en fibroblastos primarios de rata con 11 años de edad. Además, la expresión de HSP70 fue 40-50 por ciento menor en ratas adultas (22-28 meses) que en ratas jóvenes (4–7 meses) cuando se exponen a 42,5 °C durante 30 min35. En el presente estudio, las respuestas fisiológicas indicaron una variación significativa dentro del fenotipo sensible y tolerante al estrés por calor. De manera similar, HSP70 a nivel sérico se asoció con algunos parámetros fisiológicos en cabras lecheras en condiciones de pavo del sur 36. En Drosophila melanogaster, se estudió la expresión dependiente de la edad y del sexo de HSP70, HSP22 y HSF1 y se observó que la expresión de HSP70 disminuye a lo largo de la vida. -durar. La inducción de HSP es importante para mantener la homeostasis, por lo que un déficit en su expresión podría contribuir a una disminución de la tolerancia al estrés relacionada con la edad. Se sabe que se producen alternancias en la función del eje hipotálamo-pituitario (HPA) con la edad37,38,39,40,41,42,43. Aunque se ha informado que no existe un déficit relacionado con la edad para provocar una respuesta adrenocortical al estrés agudo, se ha sugerido que se produce una reducción de la actividad HPA en animales de edad avanzada después de una exposición repetida al estrés44. Por lo tanto, la disminución de la expresión de HSP70 con la edad podría reflejar un cambio en la actividad de HPA en lugar de una alternancia intrínseca en la regulación del gen HSP70. HSP70 parece desempeñar un papel protector para hacer frente a estas condiciones de estrés y puede funcionar para proteger las células contra desafíos posteriores13,45,46.

La regulación de la expresión del gen HSP70 es compleja. Del mismo modo, la disminución de la expresión de HSP70 inducida por calor en fibroblastos diploides humanos en función del paso celular (envejecimiento in vitro). El mecanismo transcripcional de HSP70 varía en relación con la edad y puede deberse a una alteración asociada con la edad en el mecanismo de señalización de la respuesta al choque térmico47. La termorregulación dependiente de la edad a nivel fisiológico se ha observado tanto en humanos como en animales de experimentación12. En un estudio preliminar que utilizó células mononucleares de sangre periférica humana, se observó una impedancia del 30 % de la transcripción del gen codificante de HSP70 inducida por calor en personas de edad en relación con individuos jóvenes48. En humanos, la Hsp70 sérica se correlacionó positivamente con la edad dentro de los 30 años y negativamente con el nivel de Hsp70 en los linfocitos después de los 40 años49. Los presentes resultados podrían mejorar nuestra comprensión del mecanismo de termotolerancia en los rumiantes durante la fase de crecimiento y los factores que afectan el crecimiento y las características económicas. Por lo tanto, es necesario analizar la correlación entre la expresión de m-RNA y la expresión de proteínas en diferentes grupos de edad durante el período de estrés por calor. Del mismo modo, también se requiere evaluar la proteína sérica del animal y determinar el índice de equilibrio de choque térmico (eHsp70/ iHsp70) en una población particular para una mejor adaptabilidad y mantener la productividad en la variación climática cambiante.

El nivel de expresión de m-RNA HSP70 a los 9 meses de edad de los animales estaba más regulado que en otros grupos de edad. Los niveles de ARNm de HSP70 fueron más altos en los individuos HST a los 3 y 9 meses de edad de la cabra Jamunapari. La edad de 9 meses es la edad para seleccionar individuos por crecimiento y otras características económicas. La expresión del gen m-RNA HSP70 en diferentes grupos de edad se correlacionó con la tolerancia al estrés por calor y esto podría usarse como biomarcador para que los criadores analicen la respuesta de HSP in vivo en rumiantes.

El experimento se llevó a cabo en la unidad de cría de Jamunapari en ICAR-Central Institute for Research on Goats (ICAR-CIRG), Makhdoom, Mathura, Uttar Pradesh, India. Jamunapari es una de las razas caprinas más productoras de leche y de gran tamaño de la India, distribuida en la región semiárida de Uttar Pradesh14. El clima en el área de estudio fue semiárido, con temperatura promedio de 45 °C y precipitación de ~ 400 mm durante el período experimental. Los animales (cabras) se alojaron por separado en función de su sexo, edad, salud y estado fisiológico, y se manejaron bajo un sistema de crianza semi-intensivo con 6-7 horas de pastoreo. Se proporcionaron alimentos para animales apropiados, incluidos forraje seco y forraje verde, según el estado fisiológico y de producción. La puntuación de la condición corporal fue adecuada y uniforme para todos los animales. A intervalos regulares, el rebaño fue vacunado y desparasitado.

La investigación se llevó a cabo en la raza de cabra Jamunapari de la región semiárida de la India y se clasificó en cuatro grupos de edad, como se muestra en la Tabla 9. En niños en crecimiento, las respuestas fisiológicas como la frecuencia respiratoria (RR), la frecuencia cardíaca (FC) , y la temperatura rectal (RT) se registraron como indicadores de estrés por calor. Las respuestas fisiológicas se registraron durante la temperatura más alta del día entre las 13.30 y las 14.30 h. La respuesta fisiológica a distintas edades se registró tres veces durante un período de 8 a 10 días (mayo a junio). Se utilizó un termómetro clínico digital para medir la temperatura rectal (precisión ± 0,1 °C). RR y HR se midieron por auscultación como se describió anteriormente 15.

Los datos de las variables meteorológicas (humedad relativa (%), insolación (h), precipitaciones (mm), temperatura de bulbo seco (DBT) y temperatura de bulbo húmedo (WBT) y temperatura) se registraron en el ICAR-Instituto Central de Investigaciones en Caprinos, Makhdoom, Farah, Mathura. El THI se calculó a partir de las temperaturas del aire de bulbo seco y húmedo para un día en particular de acuerdo con la siguiente fórmula:

donde, bulbo seco y húmedo son la temperatura en grados centígrados. La recopilación y el registro de las respuestas fisiológicas con respecto al THI más alto durante el período de pico de estrés por calor varió de 82,00 a 92,08. El THI podría utilizarse para predecir las condiciones climáticas térmicas16. Durante el período de estrés por calor extremo, la temperatura ambiental promedio osciló entre 40,0 y 49,5 °C y la HR osciló entre 14,33 y 51,0 y los animales estuvieron expuestos a la radiación durante 4 o 5 horas durante 28 días.

Para distinguir los dos fenotipos contrastantes, se utilizó la distribución de frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca altas y frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca bajas. En las cabras, la actividad respiratoria y la frecuencia cardíaca sirven como indicadores de la tolerancia al estrés por calor, y los individuos se clasifican como tolerantes o susceptibles al estrés por calor. La clasificación fenotípica del estrés por calor en cabras se ha descrito ampliamente a nivel de población en otros lugares 17,18,19,20,21.

Aproximadamente 3–4 ml de muestras de sangre fresca de cada animal se recolectaron asépticamente en tubos vacutainer heparinizados (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) a través de una punción en la vena yugular y se transportaron inmediatamente bajo refrigeración para el aislamiento del ARN. Se siguieron las pautas éticas durante la extracción de sangre. Las muestras de sangre se diluyeron con PBS, pH 7,4 (1:2) y posteriormente se depositaron en capas sobre un volumen de HiSep LSM-1077 (Hi-Media). Se tomaron precauciones para producir una interfaz limpia entre dos capas de sangre y medios HiSep. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 30 min y la fracción mononuclear blanca opaca de las células de la interfase se aspiró en tubos de microcentrífuga (MCT) nuevos. Se añadió pirocarbonato de dietilo (DEPC)-solución salina tamponada con fosfato (DPBS) para resuspender las PBMC caprinas y se centrifugaron adicionalmente para lavarlas a 5000 rpm durante 5 min. Finalmente, el sedimento celular obtenido se transfirió a un tubo de microcentrífuga estéril tratado con DEPC.

El ARN total se aisló de PBMC utilizando el método TRIzol (Invitrogen). Se resuspendió un mililitro de TRIzol para disolver el sedimento de PBMC. Posteriormente, se siguió el método de aislamiento de ARN según Rout y Kaushik et al. 17,20. La calidad y cantidad de ARN se evaluaron mediante biofotómetro (Eppendorf) usando OD260 para la concentración y las proporciones 260/280 y 260/230 para evaluar la pureza de la muestra. La integridad del ARN se probó en un gel de agarosa al 1,4 % y las muestras que pasaron la prueba de pureza (A280 ~ 1,9) se usaron para la síntesis de ADNc. Se usó 1 µg de ARN para la preparación de ADNc mediante el kit de síntesis de ADNc de la primera hebra del transcriptor (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante, y el ADNc así obtenido se almacenó a -70 °C para uso futuro. El tratamiento con ADNasa se utilizó para eliminar la contaminación por ADN del ARN, como se describió anteriormente17. El análisis de PCR en tiempo real se llevó a cabo en Light Cycler 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, EE. UU.) utilizando la mezcla maestra SYBR Green® (Roche) según las instrucciones del fabricante. La reacción se configuró en una placa de 96 pocillos y cada pocillo contenía 2 μL de muestra de cDNA, 10 μL de SYBR green I master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, EE. UU.), 1 μL (20 pmol) de los cebadores específicos y agua libre de nucleasas para hacer un volumen final de 20 l. Los cebadores del gen HSP70 (5′ TCATCGGAGATGCAGCCAAGAA-3′ y R-5′ AGATCTCCTCGGGGAAGAAGGT 3′) se utilizaron con una temperatura de hibridación de 61 °C para amplificar un fragmento de 210 pb. Se utilizaron GAPDH (F-5′ GTGATGCTGGTGCTGAGTAC3′ y R-5′ GTAGAAGAGTGAGTGTCGC-3′) y β-Actina (F-5′ TGCCCT GAGGCTCTCTTCCA′ y R-5′ TGCGGATGTCGACGTCACA-3) para normalizar la expresión génica del gen HSP70 .

El perfil térmico se estandarizó como desnaturalización inicial a 94 °C durante 10 min, seguida de 45 ciclos, desnaturalización a 94 °C durante 10 s, recocido a 61 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 20 s. Los ensayos se realizaron por duplicado. Los productos de la PCR se sometieron a un análisis de la curva de fusión en el Light Cycler 480 y, posteriormente, a una electroforesis en gel de agarosa al 3 % para confirmar la especificidad de la amplificación y el tamaño del amplicón.

La cuantificación relativa se llevó a cabo para medir el cambio en los niveles de expresión de los genes diana utilizando el método 2–∆∆Ct y el método E22. La cuantificación relativa de avance se llevó a cabo utilizando el método del máximo de la segunda derivada con el software de análisis Light Cycler 480 versión 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, EE. UU.). Todos los análisis se realizaron sobre el valor medio de Cp, que se calculó a partir de dos réplicas de muestras utilizadas en la PCR en tiempo real.

Se analizaron la expresión y las respuestas fisiológicas dentro de los fenotipos de estrés. Para las constantes de ajuste, se utilizó el análisis de medias de mínimos cuadrados de modelos mixtos para determinar el efecto estadísticamente significativo de varios factores genéticos y no genéticos23. El modelo incluye el efecto fijo de estación de nacimiento (2 niveles), tipo de nacimiento (2 niveles), sexo (2 niveles), edad (4 niveles), fenotipo (2 niveles), paridad (4 niveles) y efecto de interacción. El punto de cruce (CP) del gen HSP70 y el peso corporal de la cabra Jamunapari se ajustó como covariable lineal en el modelo.

modelo 1:

donde, Yijklmn es la observación de la i-ésima temporada de nacimiento, j-ésimo tipo de nacimiento, k-ésimo sexo, l-ésimo grupo de edad, m-ésimo fenotipo, n-ésima paridad, µ = población de media, Temporada de nacimiento = efecto fijo de la i-ésima temporada de nacimiento (febrero-marzo y octubre-noviembre = 1 y 2), Tipo de nacimientoj = efecto fijo del j-ésimo tipo de nacimiento (Soltero y Gemelos, J = 1 y 2), Sexok = efecto fijo del k-ésimo sexo (Masculino y Femenino, K = 1 y 2), Agel = efecto fijo del grupo de edad lth (3 meses, 9 meses, 12 meses y adultos l = 1, 2, 3 y 4), Phenotypem = efecto fijo del fenotipo mth (tolerante al estrés por calor y sensible al estrés por calor , m = 1 y 2), Paridadn = efecto fijo de la n-ésima paridad (Paridad = 1 a 4), Eijklmn = error residual aleatorio asociado con la observación con media 0 y varianza 1.

Toda la recolección de muestras se realizó de acuerdo con la práctica institucional y el estudio fue aprobado por el comité institucional de ética animal (IAEC/CIRG/18–19). Se siguieron las normas de llegada durante el proceso de aprobación ética.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen al Director del ICAR-Central Institute for Research on Goats, Makhdoom, Farah, Mathura y Uttar Pradesh, India, por proporcionar las instalaciones para llevar a cabo el trabajo de investigación.

Departamento de Biotecnología, Universidad GLA, 17Km Stone, NH-2, Mathura-Delhi Road, Chaumuhan, Mathura, 281406, UP, India

Rakesh Kaushik y Anjana Goel

División de Genética y Cría de Animales, ICAR-Instituto Central para la Investigación de Cabras, Makhdoom, Farah, Mathura, 281122, UP, India

Rakesh Kaushik y derrota de PK

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Correspondencia a Rakesh Kaushik o PK Rout.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kaushik, R., Goel, A. & Rout, PK Expresión diferencial y regulación del gen HSP70 durante la fase de crecimiento en rumiantes en respuesta al estrés por calor. Informe científico 12, 18310 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

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Recibido: 18 Abril 2022

Aceptado: 18 de octubre de 2022

Publicado: 31 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

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