Aislamiento de hongos filamentosos saprofitos a partir de muestras fecales de aves y evaluación de su actividad depredadora sobre ooquistes de coccidios

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8965 (2023) Citar este artículo

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Las cepas fúngicas utilizadas en el control biológico de parásitos gastrointestinales de animales se han aislado principalmente del suelo de pastos, materia orgánica en descomposición y heces de herbívoros y carnívoros. Sin embargo, su aislamiento de las aves y la evaluación de la actividad depredadora contra los parásitos GI aviares han sido escasos hasta el momento. Esta investigación tuvo como objetivo aislar hongos filamentosos de muestras fecales de aves y evaluar su actividad depredadora contra los coccidios. Se utilizó un grupo de 58 muestras fecales de pollos, gallinas ponedoras y pavos reales, recolectadas previamente entre julio de 2020 y abril de 2021, para el aislamiento de hongos filamentosos y la evaluación de su actividad depredadora in vitro contra los ooquistes de coccidios, utilizando medio de agua-agar y coprocultivos. . También se realizó la técnica de flotación de Willis para obtener suspensiones concentradas de ooquistes. Se obtuvo un total de siete aislamientos de Mucor, siendo los únicos taxones fúngicos identificados, y todos presentaron actividad lítica contra coccidios. Los aislados FR3, QP2 y SJ1 tuvieron eficacias coccidioestáticas significativas (inhibición de la esporulación) superiores al 70 %, mientras que los aislados FR1, QP2 y QP1 tuvieron eficacias coccidicidas (destrucción de los ooquistes) del 22 %, 14 % y 8 %, respectivamente, después de 14 días de incubación, siendo un proceso gradual y dependiente del tiempo. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre el aislamiento de hongos depredadores nativos de las heces de las aves y la demostración de su actividad lítica contra los coccidios.

La coccidiosis aviar es una de las enfermedades parasitarias más importantes que afectan a las aves domésticas y exóticas en todo el mundo, y es responsable de graves problemas económicos y de salud en las granjas avícolas, los parques ornitológicos y las colecciones privadas de aves1,2,3,4,5.

El control de esta enfermedad parasitaria se logra principalmente mediante quimioterapia (p. ej., anticoccidiales) y vacunas. Sin embargo, debido a la creciente preocupación por la resistencia a los medicamentos antiparasitarios, se han realizado investigaciones exhaustivas con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias alternativas o complementarias para controlar la coccidiosis en las colecciones de aves, incluida la mejora de la alimentación, la limpieza y desinfección de la casa, así como soluciones naturales como extractos de hierbas, esenciales aceites, probióticos y prebióticos, y algas5,6,7,8,9. Más recientemente, investigadores portugueses, españoles, brasileños y daneses han venido proponiendo el uso de hongos depredadores (también conocidos como "hongos nematófagos" u "hongos helmintofágicos") con características larvicidas y ovicidas como complemento de los fármacos antiparasitarios para el control de parásitos gastrointestinales. Infecciones en aves domésticas y exóticas10.

El biocontrol de infecciones parasitarias gastrointestinales animales utilizando hongos depredadores ya ha demostrado ser un complemento preciso y sostenible de los fármacos antiparasitarios, alcanzando eficacias de hasta el 97% en la reducción de la eliminación de huevos del parásito (número de huevos por gramo de heces, EPG) en caballos y rumiantes11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Sin embargo, solo unos pocos estudios in vitro e in vivo han evaluado el desempeño de los hongos depredadores contra parásitos que afectan a otros huéspedes animales, a saber, aves, perros, mapaches y wapitis10,19,24,25,26,27,28.

Los hongos depredadores también son conocidos por su ubicuidad, ya que se han aislado principalmente del suelo agrícola, la materia orgánica en descomposición y las heces de animales29. Estudios realizados en América, Europa, Asia, Oceanía y Antártida han reportado el aislamiento de hongos filamentosos con capacidad de depredar formas parasitarias intestinales, a partir de heces pertenecientes a una amplia diversidad de especies animales, entre ellas: ovinos, caprinos y bovinos30,31,32, 33,34; búfalo de agua35; burros34; coatí, mapache, lince euroasiático, oso pardo, muflón, gacela, bisonte, dromedario, guanaco y wallaby33; y caballos31,33. Los taxones más comúnmente aislados de hongos depredadores con propiedades larvicidas son Duddingtonia flagrans (Dudd.) RC Cooke (1969), Arthrobotrys spp. y Monacrosporium spp., mientras que Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & W. Gams (2001), Mucor circinelloides Tiegh (1875), Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-Jones & Samson (2011), Verticillium spp. y Trichoderma spp. han demostrado presentar propiedades ovicidas17,29,36. Sin embargo, aún no se han reportado en la literatura científica estudios sobre el aislamiento de estos hongos a partir de muestras fecales de aves.

La investigación actual tuvo como objetivo aislar hongos filamentosos nativos de muestras fecales de aves domésticas y exóticas y evaluar su actividad depredadora in vitro sobre los ooquistes de coccidios.

Del pool de 58 heces pertenecientes a gallinas, ponedoras y pavos reales, fue posible obtener siete aislamientos de hongos filamentosos: tres de pollos (FR1, FR2 y FR3) y cuatro de pavos reales (SJ1 y SJ2 – colección de aves exóticas SJ ; QP1 y QP2 – colección de aves exóticas QP).

La caracterización fúngica macroscópica y microscópica reveló resultados similares para la mayoría de los aislamientos: conidios ovoides y hialinos, sin septos; esporangios amarillentos y no ramificados, sostenidos por una columela; hifas sin tabiques; Colonias de color blanco grisáceo y esponjosas. Sin embargo, el aislamiento QP1 presentó conidios de forma oblonga e hifas más delgadas que los demás aislamientos (Fig. 1; Cuadro 1). Por lo tanto, la evaluación morfológica permitió identificar presuntivamente todos los aislamientos como Mucor sp. No se identificaron otros taxones fúngicos.

Conidios, esporangios e hifas de aislamientos de Mucor (FR1—M. circinelloides; FR2—M. circinelloides; FR3—M. circinelloides; SJ1—M. circinelloides; SJ2—M. circinelloides; QP1—M. lusitanicus; QP2—M. circinelloides; originales).

La carga de las secuencias ITS1-5.8S-ITS2 en Blastn Suite permitió establecer un Top 3 de similitud para cada aislamiento fúngico: FR1 tenía más del 99,5 % de similitud con dos cepas de Mucor circinelloides (números de acceso de GenBank OW988287 y OW985400); FR2 tenía más del 99 % de similitud con tres cepas de M. circinelloides (FN598920, HQ914900 y KJ584557); FR3 tenía una similitud del 99,8 % con dos cepas de M. circinelloides (MK396486 y KT336541); SJ1 tenía una similitud del 100 % con tres cepas de M. circinelloides (KX620480, OW987678 y OW987665); SJ2 tenía más del 99,5 % de similitud con tres cepas de M. circinelloides (MT991775, NR_126116 y FJ713065); QP1 tenía 99,8% de similitud con Mucor sp. (MK164174), Mucor lusitanicus (OP163597) y Mucor racemosus (MN726736); y QP2 tenía 100% de similitud con dos cepas de M. circinelloides (MT603934 y OW988287) (Cuadro 2).

Análisis filogenético de las secuencias ITS1-5.8S-ITS2 de todos los aislados, utilizando las cepas Mucor circinelloides CBS 195.68, Mucor lusitanicus CBS 108.17, Mucor racemosus f. racemosus CBS 260.68 y Mucor fragilis, obtenidos también del análisis BLAST, permitieron identificar los aislados FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 y QP2 como secuencias de ADNr de Mucor circinelloides, mientras que el aislado QP1 se identificó como Mucor lusitanicus (Fig. 2).

Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en la región ITS1-5.8S-ITS2, incluidas las secuencias de aislamientos y cepas de referencia GenBank. El bootstrap de verosimilitud se muestra en cada rama, y solo se consideraron valores superiores a 50. Los siete aislamientos de Mucor se muestran en negrita, seguidos de sus respectivos números de acceso de GenBank. Los cuadrados de colores representan las colecciones de aves de las que se obtuvieron los hongos: azul: gallinas; verde y naranja: pavos reales de las colecciones exóticas SJ y QP, respectivamente.

Los ensayos in vitro revelaron que todos los aislados desarrollaron actividad depredadora contra los ooquistes de Eimeria, tanto en medio WA (Fig. 3) como en coprocultivos (Fig. 4). Se pudo observar que la presencia de ooquistes desencadenó el desarrollo de hifas de hongos y su adhesión a las cápsulas de los ooquistes (actividad tipo 1). Además, durante 30 días de exposición fúngica, los ooquistes comenzaron a cambiar su morfología, mostrando sus estructuras internas poco marcadas y desarrollando vacuolas (tipo 2), hasta que las esporas comenzaron a proliferar dentro de la célula del ooquiste y finalmente provocaron su ruptura (tipo 3).

Depredación desarrollada por aislados de Mucor contra ooquistes de coccidios, en medio WA (FR1—M. circinelloides; FR2—M. circinelloides; FR3—M. circinelloides; SJ1—M. circinelloides; SJ2—M. circinelloides; QP1—M. lusitanicus; QP2 —M. circinelloides; originales).

Eimeria sp. ooquistes que muestran diferentes cambios morfológicos, luego de coprocultivos con hongos (A, C, E—deformación de la cápsula del ooquiste; B, D—rotura del ooquiste y pérdida del contenido citoplasmático; F—ooquiste esporulado; originales).

Los aislamientos de hongos mostraron diferentes desempeños líticos cuando se expusieron al microambiente fecal (ensayo de vasos de plástico), en términos de reducir la esporulación de coccidios y dañar la estructura de los ooquistes: los aislamientos FR3, QP2, SJ1, SJ2 y FR2 tuvieron eficacias de reducción significativas del 85% (p < 0,001), 85% (p < 0,001), 73% (p = 0,001), 69% (p = 0,001) y 65% (p = 0,003), respectivamente, al limitar la esporulación de los ooquistes, mientras que los aislados FR1, QP2 y QP1 tuvo eficacias de reducción significativas del 22 % (p < 0,001), 14 % (p < 0,001) y 8 % (p = 0,01), respectivamente, en la destrucción de los ooquistes, pero solo después de 14 días de exposición. Además, la eficacia ovicida fue dependiente del tiempo, ya que la viabilidad de los ooquistes difirió significativamente entre la primera y la segunda semana del ensayo, después de la exposición a los aislados FR1 (p < 0,001) y QP1 (p = 0,001). La viabilidad de los ooquistes se mantuvo estable en la copa control durante el ensayo, con porcentajes de viabilidad iguales al 97% y 94%, luego de 1 y 2 semanas de incubación, respectivamente (Cuadro 3), no registrándose diferencias estadísticas entre ambas semanas (p = 0,302).

Los hongos depredadores son un grupo de hongos filamentosos saprofitos conocidos por su capacidad para depredar y destruir larvas, huevos y ooquistes de parásitos que afectan a animales y plantas. Además de estas características funcionales, también son conocidos por otros atributos, a saber, la posibilidad de aislarse de una amplia diversidad de muestras ambientales, incluidos suelo agrícola, materia orgánica en descomposición y heces animales. Su aislamiento de la materia fecal, que con frecuencia también alberga formas ambientales de parásitos intestinales, demuestra que los hongos y los parásitos establecen relaciones de forma natural en el microambiente fecal y del suelo, siendo los primeros una fuente nutricional para los hongos depredadores17,29,36. Asimismo, el aislamiento de este tipo de hongos a partir de heces de animales sanos demuestra el equilibrio en el que se encuentran estos microorganismos dentro del ambiente intestinal, y por ende su inocuidad para animales inmunocompetentes17,19,20,28,37,38,39.

Hasta donde sabemos, este estudio permitió aislar por primera vez hongos filamentosos con capacidades depredadoras a partir de muestras fecales de aves, lo que sugiere que las aves también son "expulsores naturales" de este tipo de hongos, como informaron previamente varios autores para especies de mamíferos, a saber, rumiantes. , caballos y carnívoros mantenidos en granjas y parques zoológicos30,31,32,33,34,35.

Para esta investigación, el uso de muestras de heces de aves positivas para parásitos intestinales, junto con su inoculación inicial en un medio pobre como el Agua-Agar, permitió restringir los grupos de hongos capaces de desarrollarse en este medio y estimular el crecimiento de sólo los potenciales depredadores. hongos Además, además del medio WA, los pasos de aislamiento también incluyeron agar de harina de trigo para el rápido crecimiento, purificación y almacenamiento de hifas12. El uso de estos dos medios, sin suplementación con antibióticos, permitió aislar y almacenar con precisión hongos depredadores, en un enfoque más rápido y económico en comparación con otros medios más nutritivos como Sabouraud Agar, Corn Meal Agar, Potato Dextrose Agar o Malta Extract Agar. que a menudo se complementan con cloranfenicol para estos procedimientos.

Se obtuvieron aislamientos de hongos filamentosos en todos los lugares seleccionados y de las dos especies de aves modelo utilizadas, a pesar de que no se obtuvieron aislamientos de muestras de gallinas ponedoras. El análisis morfológico permitió concluir que todos los aislamientos pertenecen al género Mucor, con resultados cualitativos y cuantitativos rastreados para conidios, esporangios e hifas de acuerdo con la literatura publicada sobre este género40,41. Además, la evaluación molecular basada en secuencias de rDNA ITS1-5.8S-ITS2 condujo a la identificación de dos especies de hongos, Mucor circinelloides (FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 y QP2) y Mucor lusitanicus (QP1), demostrando así que estos De hecho, las secuencias diana son adecuadas para su uso en la identificación molecular de hongos depredadores, como se ha demostrado en otros estudios34,42,43,44,45.

Todos los aislados fúngicos desarrollaron actividad lítica contra los ooquistes de coccidios en medio WA y dentro del microambiente fecal, lo que permitió identificar todas las etapas de la actividad depredadora. Con respecto al primer ensayo, las eficacias de depredación difirieron entre las cepas, siendo FR1 y QP2 las más precisas para destruir Eimeria spp. ooquistes (eficacias del 22% y 14%, respectivamente), mientras que las cepas FR3, QP2 y SJ1 presentaron eficacias coccidioestáticas significativas, superiores al 70%. Estos resultados concuerdan con estudios previos realizados por investigadores portugueses y españoles27,33, que demostraron la actividad depredadora in vitro desarrollada por M. circinelloides contra huevos y ooquistes de parásitos intestinales que afectan a diferentes huéspedes animales. Además, constituye el primer artículo de investigación original que reporta la actividad coccidicida y coccidiostática de Mucor spp. contra coccidios aviares. Asimismo, la presente investigación revela por primera vez las habilidades depredadoras desarrolladas por M. lusitanicus frente a formas parásitas, las cuales tuvieron un impacto significativo en la viabilidad de los ooquistes luego de 14 días de incubación (8%), a pesar de presentar una eficacia inferior a las obtenidas. para las otras cepas. La capacidad de Mucor spp. depredar formas parasitarias intestinales aviares es una de las líneas de investigación de autores españoles y portugueses pertenecientes al grupo de investigación COPAR (Facultad de Veterinaria - Universidad de Santiago de Compostela) y LPPD (Facultad de Medicina Veterinaria - Universidad de Lisboa), respectivamente.

La detección de resultados significativos para la actividad coccidicida del hongo solo después de 14 días de incubación, y las diferencias significativas entre los datos de 7 y 14 días, para los aislados FR1 y QP1, confirma que la actividad depredadora desarrollada por este tipo de hongos es gradual y en el tiempo. -proceso dependiente. Es la presencia del parásito lo que desencadena el desarrollo de las hifas del hongo hacia él y su adhesión a su cápsula17,27,29,33,36. La migración de las hifas fúngicas hacia los huevos y ooquistes del parásito puede considerarse como una de las etapas más críticas del proceso depredador. Las hifas deben crecer y llegar al parásito, que es un proceso que puede ser retrasado por factores bióticos y abióticos nativos dentro del microambiente fecal y, por lo tanto, afectar el rendimiento y la velocidad de la acción fúngica. La microbiota fecal aviar, que está compuesta por una amplia diversidad de microorganismos nativos, a saber, bacterias de Phyla Firmicutes y Proteobacteria46, hongos de Phyla Ascomycota y Basidiomycota47, y otros microorganismos, puede haber influido negativamente en el desempeño de cada cepa fúngica, debido a competencia por los recursos y degradación de las cepas fúngicas. Se ha sugerido que la supervivencia de los hongos depredadores dentro del suelo y el microambiente fecal se ve afectada por factores bióticos como la presencia de microorganismos con características fungistáticas48. Además, un estudio realizado en Dinamarca49 demostró que el desempeño depredador en el suelo de Pochonia chlamydosporia y Metarhizium brunneum, dos especies de hongos ovicidas, contra los huevos de ascáridos aviares (Ascaridia galli y Heterakis gallinarum), se ve afectado por la microbiota del suelo. Todos estos factores deben tenerse en cuenta al planificar un ensayo de biocontrol, es decir, la dosis óptima de esporas para contrarrestar estos factores limitantes.

Finalmente, dado que todas las cepas de Mucor se aislaron de muestras fecales frescas de aves y mostraron una actividad lítica interesante sobre los ooquistes de coccidios, se puede sugerir que estas cepas resistieron el paso gastrointestinal en pollos y pavos reales y mantuvieron tanto su capacidad germinativa como depredadora, como demostrado previamente en aves para el hongo ovicida P. chlamydosporia50 y los hongos larvicidas D. flagrans y Monacrosporium thaumasium51. El hecho de que todos los aislamientos de Mucor hayan sido obtenidos de heces de aves sanas, permite también sugerir su inocuidad en aves inmunocompetentes, como han demostrado otros investigadores para caballos37, ovejas20, perros28 y wapitis19.

Hasta donde sabemos, este estudio fue el primero realizado en todo el mundo con el objetivo de aislar e identificar hongos depredadores nativos de las heces de aves y probar su eficacia in vitro contra Eimeria spp aviar. ooquistes. Los resultados sugieren que las cepas FR1 y QP2 de Mucor circinelloides son las más prometedoras para su uso en futuros ensayos de biocontrol in vitro e in vivo.

Un total de 89 muestras fecales de gallinas camperas y gallinas ponedoras (Gallus gallus domesticus; n = 46) y pavos reales (Pavo cristatus; n = 43), fueron evaluadas previamente utilizando varias técnicas coprológicas, como McMaster, Mini-FLOTAC y Coprocultivos, en el ámbito de un estudio reciente realizado en el Laboratorio de Parasitología y Enfermedades Parasitarias (LPPD) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Lisboa 3, que informó que 58 muestras (65%) fueron positivas para al menos un taxón de parásitos gastrointestinales , a saber, coccidios del género Eimeria, y nematodos como Capillaria sp., Trichostrongylus tenuis y Strongyloides pavonis. Las muestras pertenecían a animales sanos, que no presentaban signos clínicos de trastornos gastrointestinales, a saber, diarrea y/o heces con sangre.

Estas muestras se recolectaron entre julio de 2020 y abril de 2021, en una granja avícola (PF) y dos colecciones de aves exóticas ubicadas en los distritos de Lisboa (SJ) y Santarém (QP) (Portugal). La granja avícola está ubicada en el noroeste de Lisboa (39°13′54.373″ N 9°17′2.235″ W) y alberga dos poblaciones separadas de 200 pollos criados en libertad y 200 gallinas ponedoras, mientras que las colecciones de aves exóticas SJ y QP tienen 20 y 3 pavos reales, estando ubicados en el centro de Lisboa (38°42′50.241″ N 9°8′2.182″ W) y Abrantes (39°26′52.595″ N 8°10′24.949″ W), respectivamente.

Las muestras de heces se recolectaron inmediatamente después de la excreción, se empacaron en bolsas plásticas y se transportaron a LPPD, siendo almacenadas en un refrigerador (4 °C) por un tiempo máximo de 1 semana, hasta su posterior procesamiento.

Se utilizaron un total de 58 muestras de heces de aves positivas para parásitos gastrointestinales para el aislamiento e identificación de hongos filamentosos, tanto en el LPPD como en el Laboratorio de Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Lisboa (Portugal). La idea de utilizar solo estas muestras se basó en la premisa de que este tipo de hongos tienen como principal capacidad la depredación y destrucción de huevos, ooquistes y larvas de parásitos, por lo que este procedimiento estimularía el crecimiento de posibles hongos depredadores y restringiría el desarrollo de otros grupos de hongos.

Para ello, se colocó aproximadamente 1 g de cada muestra fecal sobre la superficie del medio Water-Agar (WA, 2%), y luego se incubó a 26 °C durante 3 semanas. Una vez registrado el crecimiento de hongos filamentosos, las colonias individuales se sometieron a 3-4 pases, utilizando Agar Harina de Trigo (WFA, 2%) y ciclos de incubación a 26 °C durante 1 semana, hasta lograr cultivos puros. Se utilizaron dos réplicas para cada muestra fecal33.

Todos los aislamientos se sometieron a identificación morfológica a nivel de género, con base en Hernández et al.33, Arroyo-Balán et al.34, Ocampo-Gutiérrez et al.42 y Cooke y Godfrey52. Se realizaron mediciones (largo y ancho) y descripción morfológica de un total de 10 esporangios e hifas (aumento total 200X y 400X) y conidios (aumento total 1000X, en aceite de inmersión), utilizando una tinción de azul de algodón lactofenol y un microscopio óptico. . Asimismo, se realizó la caracterización macroscópica de las colonias de cada aislado, en cuanto a su textura y color.

Se establecieron suspensiones de esporas para cada aislamiento en agua destilada y se calculó su concentración final en cámara de Neubauer. Todas las suspensiones fúngicas se estandarizaron a 106 esporas/mL.

Los aislamientos fúngicos se conservaron en placas Petri y frascos de vidrio con WFA a temperatura ambiente, y 850 μL de cada suspensión acuosa fúngica se almacenaron a -20 °C en criotubos con glicerol estéril al 15 % (v/v)40.

La extracción de ADN de todos los aislados fúngicos se realizó con el kit EZNA® Fungal DNA Mini (Omega Bio-Tek, Norcross, GA). Se usó un hisopo calibrado de 1 μL para recolectar micelio fresco de cada aislado fúngico. Este procedimiento se repitió 5 veces, y el volumen total de micelio se colocó en los respectivos tubos de microcentrífuga de 2 mL, a los que también se les añadió 600 μL de tampón de lisis FG1. La mezcla se agitó para dispersar todos los grumos y se incubó a 65 °C durante 10 min. Luego, se agregaron 140 μL de tampón FG2 (ácido acético glacial) y la suspensión se agitó con vórtex. Los tubos se incubaron en hielo durante 5 min y luego se centrifugaron a 10 000 × g durante 10 min. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos de microcentrífuga, a los que también se añadieron 0,7 volúmenes de isopropanol. Después del vórtice, las suspensiones se centrifugaron a 10 000 × g durante 2 min. Se descargaron los sobrenadantes y se agregaron 300 μL de agua destilada estéril a cada sedimento de ADN y luego se agitaron. Se añadió un total de 4 μL de RNasa A a cada tubo, seguido de 150 μL de tampón FG3 (clorhidrato de guanidina) y 300 μL de etanol al 100 %, utilizando siempre el vortex para mezclar las suspensiones. Se realizaron más pasos utilizando minicolumnas de ADN HiBind® para eliminar polisacáridos, compuestos fenólicos e inhibidores de enzimas de lisados fúngicos, debido a su unión reversible de ácidos nucleicos. El ADN puro se eluyó en 200 μL de agua destilada estéril y su pureza y concentración se verificaron con NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EE. UU.). Finalmente, los tubos se almacenaron a -20 °C.

La amplificación del ADNr se realizó para cada aislamiento dirigido a la región ITS1-5.8S-ITS2, utilizando 10–66 ng de ADN genómico y cebadores ITS1 (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) e ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC). Estos procedimientos siguieron las pautas descritas por Arroyo-Balán et al.34 y Lau et al.53, y la reacción de PCR se realizó en un volumen de 25 μL, compuesto por: 0,4 μL ITS1 (0,8 μM), 0,4 μL ITS4 (0,8 μM ), 10 μL de plantilla de ADN, 10 μL de NZYTaq II Green Master Mix (NZYTech, Lisboa, Portugal) y 4,2 μL de agua de biología molecular. También se utilizó un control negativo, reemplazando el ADN por agua.

Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: un paso inicial de desnaturalización a 95 °C por 10 min, seguido de 60 ciclos compuestos por un paso de desnaturalización a 94 °C por 15 s, un paso de recocido a 55 °C por 30 s y un paso de extensión a 72 °C durante 30 s. Finalmente, se realizó un paso de extensión a 72 °C durante 5 min. Los amplicones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5 %), se tiñeron con 2,5 μL de GreenSafe Premium (NZYTech) e incluyeron NZYDNA Ladder VI (50–1500 pb; NZYTech). El gel se corrió a 85 V por 40 min y se visualizó utilizando el equipo ChemiDoc y el Image Lab™ Software (Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA).

Cada producto de PCR se purificó utilizando perlas magnéticas (MCLAB, California, EE. UU.) para la precipitación del ADN, seguido de un lavado de gránulos con etanol al 85 % y posterior elución en agua MiliQ. Los sobrenadantes obtenidos se usaron para secuenciación adicional. Los productos de PCR purificados se secuenciaron utilizando el cebador ITS1 y el kit de secuenciación de ciclo BigDye™ Terminator versión 3.1, y también con el equipo DNA Analyzer 3730 XL (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Las secuencias se evaluaron utilizando Chromas Software, versión 2.6.6 (Technelysium Pty, Ltd., South Brisbane, Australia), y se verificó su calidad en base a picos bien definidos de los nucleótidos en los cromatogramas. Luego, las secuencias se explotaron utilizando Blastn Suite (BLAST®) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), para realizar un análisis preliminar de las alineaciones significativas de las secuencias y seleccionar taxones fúngicos con fines comparativos en el análisis filogenético. Para cada aislamiento fúngico, se estableció un Top 3 de similitud de secuencia en función de los resultados de Blastn Suite.

Las secuencias se editaron manualmente con el software MEGA, versión 11.0.1154, para verificar la calidad de las secuencias y los nucleótidos no detectados, eliminar los cebadores y realizar su alineación con el algoritmo MUSCLE. Según la búsqueda BLAST®, las secuencias de la región ITS1-5.8S-ITS2 de los aislados Mucor circinelloides CBS 195.68 (número de acceso: NR_126116.1), Mucor lusitanicus CBS 108.17 (número de acceso: NR_126127.1), Mucor racemosus f. racemosus CBS 260.68 (número de acceso: NR_126135.1) y Mucor fragilis (número de acceso: FJ904925.1) también se incluyeron. Se utilizó el servidor web IQ-TREE55 para generar un árbol filogenético de máxima verosimilitud a partir de 1000 repeticiones. La opción ModelFinder de IQ-TREE se configuró para la autodeterminación del mejor modelo56. Se eligió la herramienta de arranque ultrarrápido (1000 alineaciones de arranque) para obtener estadísticas de soporte de nodos, con sus ramas solo respaldadas por valores de arranque por encima de 5057. El árbol filogenético se visualizó y editó usando el software MEGA, y se eligió M. racemosus para enraizar el árbol. , ya que en el árbol filogenético de máxima verosimilitud inicial, esta cepa de referencia estaba claramente más distante filogenéticamente de los otros aislados fúngicos y cepas de referencia, y tanto enraizar el árbol en esta cepa como en Midpoint dio como resultado árboles filogenéticos idénticos.

Las secuencias de nucleótidos ITS1-5.8S-ITS2 de los siete aislados fúngicos se depositaron en la base de datos GenBank con los siguientes números de acceso: ON150886 (M. circinelloides, FR1), ON150887 (M. circinelloides, FR2), ON150888 (M. circinelloides, FR3), ON150889 (M. lusitanicus, QP1), ON150890 (M. circinelloides, QP2), ON150891 (M. circinelloides, SJ1) y ON150892 (M. circinelloides, SJ2).

Se realizaron dos tipos de ensayos de biocontrol con el objetivo de probar la actividad depredadora de todos los aislamientos fúngicos contra los coccidios aviares: un ensayo cualitativo en placas de Petri que contenían medio WA y un ensayo de coprocultivo cuantitativo-cualitativo33.

Para obtener suspensiones concentradas de ooquistes, se procesaron muestras fecales de pollos, gallinas ponedoras y pavos reales, positivas para Eimeria spp., mediante la técnica de flotación de Willis. Brevemente, se mezclaron dos gramos de heces con 28 ml de solución saturada de sacarosa (gravedad específica 1,2); la suspensión fecal se filtró y vertió en tubos de ensayo de 10 mL, hasta la formación de un menisco convexo, sobre el cual se colocó un cubreobjetos; los tubos de ensayo se dejaron en la mesa de laboratorio por 10 min, luego el cubreobjetos se lavó con agua destilada a nuevos tubos de ensayo, los cuales se centrifugaron a 2000 rpm por 10 min; se eliminó parcialmente el sobrenadante, dejando solo 1 mL en cada tubo; el sedimento y el sobrenadante se mezclaron con una pipeta Pasteur y se visualizaron 100 μL de la suspensión de ooquistes con un microscopio óptico, con un aumento total de 400X. Se realizaron dos lecturas y el recuento total de ooquistes se multiplicó por 10 para calcular la concentración de coccidios (es decir, ooquistes/mL).

En el primer ensayo, se inoculó un volumen total de 500 μL de cada aislado fúngico (106 esporas/mL) en la superficie del medio WA, al que también se le agregó 1 mL de suspensión de ooquistes, con una concentración promedio de 140 ooquistes/mL. . Se usaron dos réplicas para cada aislamiento y también se usó un control positivo para evaluar la supervivencia de los ooquistes sin inocular hongos y probar la contaminación por otras especies de hongos. Las placas se sellaron con Parafilm y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 días. Luego, se observaron las placas para identificar la actividad depredadora, la cual se caracterizó de la siguiente manera: fijación de las hifas a la cápsula del ooquiste pero sin daño morfológico (actividad tipo 1); la cápsula de los ooquistes y las estructuras internas presentan cambios morfológicos, pero sin penetración fúngica (tipo 2); las hifas penetran en el citoplasma del ooquiste, crecen en su interior y lo destruyen (tipo 3)27,33,58.

El segundo ensayo tuvo como objetivo evaluar la eficacia de los aislados fúngicos en la degradación de los ooquistes, luego de la exposición al microambiente fecal. Cuatro gramos de muestras fecales de pavo real de la colección exótica SJ, positivas para Eimeria spp. (n = 20), se mezclaron suavemente y se colocaron en ocho vasos de plástico. Se agregaron un total de 4 mL de suspensiones fúngicas (106 esporas/mL) a los respectivos vasos de prueba (uno por aislado fúngico, n = 7), mientras que se vertieron 4 mL de agua destilada en el vaso de control (n = 1). Luego, las copas se cubrieron con papel de aluminio perforado y se dejaron incubando durante dos semanas, a 26 °C. Después de una y dos semanas de incubación, se realizaron dos flotaciones en cada copa de prueba y control, utilizando 2 g de heces escogidas al azar de distintas partes de la muestra y mezclándolas con 28 mL de solución saturada de sacarosa (gravedad específica 1,2), con el objetivo de calcular la proporción de ooquistes esporulados/no esporulados y viables/no viables (después de una semana) y la proporción de ooquistes viables/no viables (en cada semana). Se realizaron dos lecturas en cada vaso y período de tiempo, contando un total de 100 ooquistes por lectura.

Para cada aislado fúngico y período de tiempo (7 y 14 días), la reducción de la viabilidad de los ooquistes fecales (FOVR) (1) y la reducción de la esporulación de los ooquistes fecales (FOSR) (2) se calcularon de la siguiente manera19,20,59:

La caracterización de la apariencia de los ooquistes se adaptó de los procedimientos establecidos para los huevos de ascáridos por Cazapal-Monteiro et al.27, considerándose los ooquistes como inviables si se observaba al menos una de las siguientes características: estructuras internas poco marcadas, forma anormal de los ooquistes, citoplasma que contiene vacuolas y/o ruptura de la cápsula.

Además, dado que la mayoría de las especies de Eimeria que afectan a los Galliformes esporulan en menos de 2 días, a temperaturas que oscilan entre 20 y 30 °C5,60, la evaluación de FOSR se realizó de acuerdo con los siguientes criterios: al final de la primera semana de incubación, la identificación de ooquistes no esporulados en las copas de prueba se atribuyó a una actividad coccidiostática desarrollada por la exposición a los respectivos aislamientos fúngicos.

Se utilizó el software Microsoft® Excel® para Microsoft 365 MSO (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE. UU.), para el almacenamiento de datos y la edición de tablas y gráficos.

Para las estadísticas descriptivas iniciales (media y errores estándar) se utilizó el software IBM® SPSS® Statistics versión 27 para Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA). Además, este software se utilizó para construir tablas de 2 × 2 utilizando datos del ensayo in vitro (viabilidad y esporulación), con el objetivo de realizar una prueba de Chi-Cuadrado, para comparar los resultados obtenidos entre los ooquistes expuestos a cada aislamiento fúngico (tazas de prueba ) y al agua (vaso de control). Además, esta prueba se usó para evaluar la dependencia del tiempo de la actividad ovicida desarrollada por cada aislamiento fúngico en los ooquistes. Se utilizó un nivel de significación de p < 0,05 para todas las pruebas.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual pertenecen al Centro de Investigación Interdisciplinaria en Salud Animal (CIISA), Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Lisboa. Las secuencias de ADNr obtenidas de los siete aislamientos de Mucor se cargaron en la base de datos GenBank el 5 de abril de 2022, y los números de acceso se proporcionaron en la sección Métodos. Todos los datos pueden estar disponibles solicitándolos al Autor de correspondencia.

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Esta investigación ha sido financiada por los Proyectos CIISA/FMV UIDB/00276/2020 y LA/P/0059/2020—AL4AnimalS (ambos financiados por FCT), así como por el Proyecto ED431B 2021/07 (Consellería de Cultura, Educación e Universidades, Xunta de Galicia). Además, João Lozano y Mariana Louro son titulares de las Becas de Investigación Doctoral 2020.09037.BD y UI/BD/152818/2022, respectivamente (ambas financiadas por la FCT). Queremos agradecer a los Laboratorios de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, y de Microbiología e Inmunología (CIISA-FMV, Lisboa, Portugal), y a sus líderes, los Profesores Doctores Isabel Fonseca y Luís Tavares, respectivamente, por brindar apoyo a esta investigación y permitir realizarlo en las respectivas instalaciones. También, un agradecimiento especial al grupo de investigación COPAR (Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, España) por todo el apoyo en el aislamiento e identificación de hongos depredadores y los ensayos in vitro. Finalmente, nos gustaría agradecer a STAB VIDA, Lda. (Caparica, Portugal) para purificar y secuenciar los productos de PCR de hongos.

CIISA—Centro de Investigación Interdisciplinaria en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Lisboa, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477, Lisboa, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira & Luís Madeira de Carvalho

Laboratorio Asociado de Ciencias Animales y Veterinarias (AL4AnimalS), 1300-477, Lisboa, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira & Luís Madeira de Carvalho

Exoclinic – Clínica Veterinaria de Aves y Exóticos, Quinta de Santo António, 1495-049, Miraflores, Portugal

cristina almeida

Vetnatura – Serviços Veterinários, Lda., Calçada de Palma de Baixo, 1600-176, Lisboa, Portugal

pedro melo

Corteza – Bioparque Barquinha, 2260-999, Vila Nova da Barquinha, Portugal

joao paulo rodrigues

Grupo de Investigación Control de Parásitos (COPAR, GI-2120), Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27142, Lugo, España

Adolfo Paz Silva

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JL diseñó el estudio, proporcionó recursos, realizó los experimentos, seleccionó los datos, analizó los resultados y escribió el borrador original del manuscrito. ML proporcionó recursos, analizó los resultados y revisó el manuscrito. CA proporcionó recursos y revisó el manuscrito. ACV proporcionó recursos y revisó el manuscrito. PM proporcionó recursos. JPR proporcionó recursos. MO proporcionó recursos, colaboró en los experimentos, revisó el manuscrito y co-supervisó el estudio. APS proporcionó recursos, colaboró en los experimentos, revisó el manuscrito y co-supervisó el estudio. LMC proporcionó recursos, colaboró en los experimentos, revisó el manuscrito y supervisó el estudio. Todos los autores han leído este manuscrito y aceptaron enviarlo.

Correspondencia a Joao Lozano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lozano, J., Louro, M., Almeida, C. et al. Aislamiento de hongos filamentosos saprofitos a partir de muestras fecales de aves y evaluación de su actividad depredadora sobre ooquistes de coccidios. Informe científico 13, 8965 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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Recibido: 24 diciembre 2022

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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