La sobrecarga de hierro en la dieta aumenta la inflamación hepática inducida por la dieta occidental y altera el metabolismo de los lípidos en ratas que comparten similitudes con el DIOS humano

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21414 (2022) Citar este artículo

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La sobrecarga hepática de hierro a menudo coincide con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés). El síndrome de sobrecarga de hierro dismetabólico (DIOS, por sus siglas en inglés) se caracteriza por un aumento en las reservas de hierro del hígado y el cuerpo y de los componentes del síndrome metabólico. Evidencias crecientes sugieren una superposición entre NAFLD con sobrecarga de hierro y DIOS; sin embargo, el mecanismo por el cual el hierro está involucrado en su patogenia sigue sin estar claro. Aquí investigamos el papel del hierro en la patología de un modelo de rata de NAFLD con sobrecarga de hierro. Las ratas alimentadas con una dieta occidental (alta en grasas y alta en fructosa) durante 26 semanas presentaron esteatosis hepática con aumento del peso corporal y dislipidemia. La adición de una sobrecarga de hierro en la dieta a la dieta occidental aumentó aún más los triglicéridos y el colesterol séricos y mejoró la inflamación hepática; el hígado afectado tenía una intensa deposición de hierro en los macrófagos sinusoidales/células de Kupffer, asociada con la translocación nuclear de NFκB y la regulación al alza de las citoquinas relacionadas con Th1/M1. El presente modelo sería útil para investigar el mecanismo que subyace al desarrollo y progresión de NAFLD así como DIOS, y para dilucidar un papel importante del hierro como uno de los factores de "golpes múltiples".

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) es la causa más común de enfermedades hepáticas crónicas en todo el mundo en la actualidad. Está fuertemente asociado con el síndrome metabólico (MetS), que incluye obesidad, diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), dislipidemia e hipertensión. La prevalencia de NAFLD en la población mundial se estima en un 25 %, con un aumento constante en la última década debido al mayor número de pacientes con MetS1,2. La mayoría de los pacientes tienen una condición de acumulación de triglicéridos hepáticos con daño e inflamación hepatocelular mínimos (esteatosis simple o hígado graso no alcohólico [NAFL]), mientras que algunos pacientes tienen acumulación de triglicéridos hepáticos con más daño e inflamación hepatocelular (esteatohepatitis no alcohólica; NASH), que puede progresar a fibrosis/cirrosis hepática y finalmente a carcinoma hepatocelular (CHC). Los estudios epidemiológicos estiman que la prevalencia de NASH es del 59 % y del 6,7 al 30 % entre los pacientes con NAFLD con biopsia y los pacientes con NAFLD sin biopsia, respectivamente, y el 0,5 % de ellos progresa a HCC1.

Aunque se han realizado intensos esfuerzos para encontrar algunos agentes terapéuticos para NAFLD con una mejoría del estado de la enfermedad, todavía quedan muchos desafíos por resolver3. Una de las principales razones de esta dificultad es que la patogenia subyacente a la progresión de NAFLD es bastante compleja y multifactorial. Una hipótesis de "múltiples éxitos", que establece que diferentes factores etiológicos (p. ej., resistencia a la insulina, lipotoxicidad, estrés oxidativo, alteración de la inmunidad y disbiosis intestinal) actúan de forma paralela y sinérgica durante el desarrollo y progresión de la enfermedad, es ampliamente aceptada para comprender la patogénesis de NAFLD4,5. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales preclínicos que representen el espectro completo de NAFLD humano es muy desafiante, pero es muy necesario para el desarrollo de terapias efectivas para NAFLD6,7.

El hierro es un micronutriente esencial para el cuerpo, ya que es necesario para procesos biológicos vitales como el transporte de oxígeno, la respiración mitocondrial, la síntesis de ADN nucleico y la señalización celular8,9. El exceso de hierro se acumula en ciertos órganos, incluidos el hígado, el corazón y las glándulas endocrinas, lo que provoca lesiones en los tejidos a través de la generación de especies reactivas de oxígeno por la reacción de Fenton9. La desregulación del hierro, que se manifiesta como niveles de hepcidina sérica inapropiadamente bajos e hiperferritinemia, es común en las enfermedades hepáticas crónicas, mientras que se han informado niveles altos de hepcidina sérica y hepática en NAFLD, ya que se considera que tanto la obesidad como la diabetes aumentan la producción de hepcidina10,11. La acumulación de hierro en el hígado estuvo presente en el 30-35 % de los pacientes con NAFLD y varios estudios epidemiológicos han sugerido una asociación entre las reservas corporales elevadas de hierro y MetS, NAFLD y resistencia a la insulina12,13,14. Además, otros estudios han sugerido que la presencia y el patrón de depósito hepático de hierro están asociados con fibrosis hepática avanzada, lesión de hepatocitos y esteatohepatitis en NAFLD12,15,16.

El síndrome de sobrecarga de hierro dismetabólico (DIOS) es una condición definida por un aumento en las reservas de hierro del cuerpo asociado con varios componentes de MetS en ausencia de cualquier causa identificable de sobrecarga de hierro. Se diagnostica clínicamente con hiperferritinemia, saturación de transferrina normal o moderadamente aumentada y presencia de componentes del MetS17,18,19,20,21. Se considera que DIOS y NAFLD están fuertemente correlacionados; aproximadamente el 50 % de los pacientes con DIOS tienen NAFLD, mientras que más del 30 % de los pacientes con NAFLD tienen DIOS18,21.

Aunque las evidencias emergentes han sugerido una asociación entre NAFLD, sobrecarga de hierro y MetS, los mecanismos por los que el hierro promueve la progresión de estas enfermedades metabólicas siguen sin estar claros18. El modelo animal aplicable con sobrecarga de hierro, que representa las condiciones hepáticas y de todo el cuerpo de la NAFLD humana, nos permitiría comprender la influencia del hierro en las enfermedades metabólicas. Anteriormente mostramos un aumento en la inflamación hepática con la regulación positiva de las citocinas proinflamatorias mediante la suplementación con hierro en la dieta en un modelo de rata de NAFLD22. Sin embargo, el modelo anterior solo tenía una leve acumulación de hierro en el hígado; es insuficiente para investigar el enlace cruzado entre NAFLD y DIOS. Hasta donde sabemos, no existe un modelo establecido que represente los fenotipos clínicos y patológicos tanto de NAFLD con sobrecarga de hierro como de DIOS. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo revelar el papel patológico de la sobrecarga de hierro en la patogenia de la NAFLD, centrándose en si la sobrecarga de hierro afecta a la enfermedad y cómo afecta a la enfermedad como uno de los factores de "golpes múltiples", utilizando un nuevo modelo animal con resultados a largo plazo. alimentación de una dieta occidental con suplementos de hierro.

Las ratas de los grupos de dieta occidental (WD) y occidental más dieta alta en hierro (WD + Fe) mostraron un aumento de peso corporal basado en una mayor ingesta de calorías, en comparación con los grupos de control (Cont) y dieta alta en hierro (Fe), respectivamente ( Figura 1b, c). Las ratas en el grupo de dieta alta en hierro (Fe) tenían un peso corporal más bajo que el grupo Cont, a pesar de su mayor consumo de alimentos y calorías (Fig. 1a-c). Se ha demostrado que el aumento del apetito en roedores alimentados con una dieta rica en hierro está asociado con la regulación a la baja de leptina dependiente de la proteína de unión al elemento sensible al AMPc (CREB) en los adipocitos23. El menor peso corporal en el grupo Fe puede explicarse con un hallazgo previo de que la sobrecarga de hierro tiene efectos metabólicos beneficiosos mediante la regulación positiva de la actividad de la proteína quinasa activada por AMP en el músculo esquelético y el hígado 24. Los hígados de los grupos Cont y Fe presentaron una apariencia macroscópica normal . Por otro lado, los hígados de los grupos WD y WD + Fe tenían hepatomegalia con decoloración difusa (Fig. 1d), sugestiva de hígado graso. El peso absoluto y relativo del hígado aumentó en los grupos WD y WD + Fe en comparación con los grupos Cont y Fe (peso absoluto del hígado; P = 0,0055 para WD frente a Cont, P < 0,0001 para WD + Fe frente a Cont, P = 0,0049 para WD vs Fe y P < 0,0001 para WD + Fe vs Fe, peso relativo del hígado, P = 0,0003 para WD vs Cont, P < 0,0001 para WD + Fe vs Cont, P = 0,006 para WD vs Fe y P < 0,0001 para WD + Fe frente a Fe); fueron más altos en WD + Fe que en el grupo WD (peso absoluto del hígado; P = 0.0174, peso relativo del hígado; P = 0.0025) (Fig. 1e, f). Histológicamente, los hígados de los grupos Cont y Fe no tenían anomalías detectables (Fig. 2a, d, e, h). Se observó esteatosis microvesicular difusa con esteatosis macrovesicular dispersa en los grupos WD y WD + Fe, siendo su grado similar entre ambos grupos (fig. 2b, c, f, g). Las vacuolas de lípidos en los hepatocitos de los grupos WD y WD + Fe se tiñeron de rojo con aceite rojo O (Fig. 2i-l). De acuerdo con la esteatosis histológica, el contenido de triglicéridos hepáticos aumentó en los grupos WD (P < 0,0001 vs. Cont, P = 0,0001 vs. Fe) y WD + Fe (P = 0,0012 vs. Cont, P = 0,0016 vs. Fe), sin diferencia significativa entre los dos grupos (Fig. 2m).

Cambios temporales en (a) el consumo de alimentos, (b) la ingesta de calorías y (c) el peso corporal de los grupos de control, WD, WD + Fe y Fe. La ingesta de calorías se calculó multiplicando el consumo de alimentos por las calorías totales estimadas de cada dieta que se muestra en la Tabla complementaria 1. ( d ) Imágenes generales de los hígados de los grupos de control, WD, WD + Fe y Fe en la semana 26. Barra: 1 cm. (e) Peso absoluto y (f) relativo del hígado por 100 g de peso corporal en los grupos de control, WD, WD + Fe y Fe en la semana 26. Los datos se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, †P < 0,05 frente a WD y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey.

Histopatología del hígado en (a) control, (b) WD, (c) WD + Fe y (d) grupos Fe en la semana 26. CV: vena central. Barra: 100 µm. (e–h) Mayor aumento del anuncio, respectivamente. Barra: 15 µm. Secciones teñidas con aceite rojo O en el hígado de (i) control, (j) WD, (k) WD + Fe y (l) grupos Fe en la semana 26. Barra: 50 µm. (m) Contenido de triglicéridos hepáticos en la semana 26. Los datos se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey.

El hierro sérico y hepático aumentó en los grupos Fe (hierro sérico; P < 0,0001, hierro hepático; P = 0,0071) y WD + Fe (hierro sérico; P = 0,0003, hierro hepático; P = 0,0262) en comparación con el grupo Cont (Fig. 3a , b), asociado con una regulación al alza de la hepcidina hepática (P < 0,0001 para Fe y WD + Fe vs. Cont) (Fig. 3d), el principal regulador de la homeostasis del hierro sistémico8,25. El hierro sérico también aumentó en el grupo WD en comparación con el grupo Cont (P = 0,0025). La saturación de transferrina, que indica la capacidad de unión de la transferrina transportadora de hierro al hierro libre circulante25, aumentó en el grupo Fe en comparación con otros 3 grupos (P < 0,0001 frente a Cont, WD y WD + Fe) (Fig. 3c). La saturación de transferrina no cambió en los grupos WD y WD + Fe a pesar del aumento del hierro sérico; el aumento del hierro sérico sin aumento de la saturación de transferrina es una característica clínica del DIOS humano17,21. La ferritina sérica, un marcador ampliamente utilizado para las reservas corporales de hierro en humanos25, no cambió significativamente entre todos los grupos; no se correlacionó con las reservas hepáticas de hierro (Fig. S1a, b complementarias), como se describe en otra parte26. La tinción de hierro de Perls reveló una acumulación de hierro en las células sinusoidales y los hepatocitos en los grupos WD + Fe y Fe en comparación con los grupos Cont y WD (Fig. 3g-j). La acumulación de hierro fue más intensa en las células sinusoidales que en los hepatocitos de ambos grupos Fe y WD + Fe. La inmunohistoquímica combinada con tinción de hierro demostró que el hierro se acumulaba principalmente en macrófagos Iba1 positivos/células de Kupffer en la sinusoide (Fig. 3k, l). La acumulación de hierro puede inducir estrés oxidativo y, por lo tanto, a menudo se ha implicado como uno de los factores clave para la progresión de NAFLD27,28. El contenido hepático de malondialdehído (MDA), un biomarcador de uso común para el estrés oxidativo (peroxidación lipídica)28, aumentó en el grupo WD + Fe (P = 0,0403 frente a WD) (Fig. 3e), mientras que el glutatión hepático (GSH)/ la proporción de glutatión oxidado (GSSG), un indicador del equilibrio estrés oxidativo-antioxidante29, no cambió significativamente (Fig. 3f). Estos resultados sugirieron que el estrés oxidativo, al menos a nivel de todo el tejido, no juega un papel importante en la patogénesis de la enfermedad del hígado graso en este modelo.

Datos bioquímicos sanguíneos de (a) hierro sérico, (b) contenido de hierro en el hígado, (c) saturación de transferrina y (d) expresión hepática de ARNm de hepcidina en la semana 26. (d) Los datos se normalizaron a ARNr 18S y se expresaron como cambio de pliegue del grupo de control. (e) Contenido hepático de malondialdehído (MDA) en la semana 26, medido por el método de sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico. (f) Proporción del contenido hepático de glutatión (GSH)/glutatión oxidado (GSSG) en la semana 26. Los datos se presentan como recuadros y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, †P < 0,05 frente a WD y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey. Imágenes de la tinción de hierro de Perls en el hígado de (g) control, (h) WD, (i) WD + Fe y (j) grupos Fe en la semana 26. Barra; 50 micras. IHC para Iba1 combinado con tinción de hierro de Perls en grupos (k) WD + Fe y (l) Fe en la semana 26. Las puntas de flecha indican acumulación de hierro (teñidas de azul) en macrófagos/células de Kupffer positivas para Iba1 (teñidas de marrón). Bar; 30 micras.

Los triglicéridos séricos aumentaron solo en el grupo WD + Fe (P = 0.0149 vs. Cont) (Fig. 4a). El colesterol sérico total aumentó en los grupos WD (P < 0,0001 frente a Cont y Fe) y WD + Fe (P < 0,0001 frente a Cont y Fe) en comparación con los grupos Cont y Fe; fue mayor en el grupo WD + Fe que en el grupo WD (P < 0.0001) (Fig. 4b). Los ácidos grasos libres, la glucosa y la insulina en suero no difirieron significativamente entre todos los grupos (Fig. 4c-e); sin embargo, el valor de insulina sérica fue muy alto en una de las cuatro ratas del grupo WD + Fe (12949 pg/mL vs. 2107 ± 1698 pg/mL en el grupo Cont). La fosfatasa alcalina sérica (ALP) aumentó con la alimentación con dieta occidental (P = 0,0185 para WD frente a Cont, P = 0,0014 para WD frente a Fe y P = 0,0093 para WD + Fe frente a Fe) (Fig. 4f). La aspartato aminotransferasa sérica y la alanina aminotransferasa no aumentaron en los grupos WD y WD + Fe y disminuyeron en el grupo Fe (Figura complementaria S2a, b).

Datos bioquímicos en sangre de (a) triglicéridos séricos, (b) colesterol total, (c) ácidos grasos libres, (d) glucosa, (e) insulina y (f) fosfatasa alcalina (ALP) en la semana 26. Los datos se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, †P < 0,05 frente a WD y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey.

En el hígado, la insulina promueve la fosforilación de los sustratos del receptor de insulina (IRS1/2) en el residuo de tirosina. Cuando IRS1 se fosforila en Tyr612, interviene en las funciones metabólicas de la insulina, como la supresión de la gluconeogénesis30. Después de la fosforilación de tirosina de IRS1/2, las serina/treonina-proteína quinasas Akt, especialmente Akt2, se activan por fosforilación y luego suprimen la fosforilación y la translocación nuclear de la proteína O1 de la caja de la horquilla (FOXO1), un factor de transcripción que regula la gluconeogénesis y la glucogenólisis30,31. . FOXO1 estimula directamente la transcripción de Pck1 y G6pc, los genes gluconeogénicos hepáticos clave30,31. Se considera que los pacientes con MetS con resistencia a la insulina pueden tener una inhibición de la fosforilación de tirosina de IRS1, lo que conduce a una regulación negativa de la fosforilación de Akt2; la supresión de la activación de Akt2 mantiene a FOXO1 en el núcleo, lo que resulta en una activación persistente o excesiva de la gluconeogénesis hepática32. En este estudio, la expresión hepática de IRS1 total no difirió significativamente entre todos los grupos (Fig. 5a), mientras que la fosforilación de tirosina en IRS1 (Tyr612) disminuyó en WD (P = 0,0002 frente a Cont y P < 0,0001 frente a Fe) y WD + Fe (P = 0,0002 frente a Cont y P = 0,0087 frente a Fe) en comparación con los grupos Cont y Fe (Fig. 5b). La expresión de Akt2 total y fosforilada también disminuyó en WD (Akt2 total; P = 0,0027 vs Cont y P = 0,0259 vs Fe, Akt2 fosforilada; P = 0,007 vs Fe) y WD + Fe (Akt2 total; P = 0,0002 vs Cont y P = 0,0013 vs Fe, Akt2 fosforilada, P = 0,0272 vs Cont y P = 0,0002 vs Fe) (Fig. 5c, d). La translocación nuclear de FOXO1 no cambió significativamente entre los cuatro grupos (Fig. 5e, f). Además, la expresión hepática de los genes Pck1 y G6pc se reguló a la baja en los grupos WD y WD + Fe (Figura complementaria S3a, b). Estos datos sugieren que la vía de la señal de la insulina está alterada al menos parcialmente en el hígado de los grupos WD y WD + Fe.

Expresión hepática de (a) IRS1 total, (b) fosfo-IRS1 (Tyr 612), (c) Akt2 total, (d) fosfo-Akt2 del lisado de tejido hepático completo en la semana 26. Expresión hepática de expresión de FOXO1 en el ( e) fracciones citoplasmática y (f) nuclear en la semana 26. Se usaron GAPDH e histona H2B para un control de carga en todo el tejido/fracción citoplasmática y nuclear, respectivamente. Los datos se expresan como cambio de pliegue del control y se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey.

El examen histopatológico reveló un mayor número de focos inflamatorios en el lóbulo hepático (Fig. 6a, b) en WD (P = 0,0011 vs Cont y P = 0,0011 vs Fe) y WD + Fe (P < 0,0001 vs Cont y P < 0,0001 frente a Fe) grupos; el número es mucho mayor en WD + Fe que en el grupo WD (P < 0,0001). La expresión hepática de genes de citoquinas aumentó en WD (IL1β; P = 0,0254 vs. Cont, IL10; P = 0,038 vs. Cont) y/o WD + Fe (TNFα; P = 0,0035 vs. Cont y P = 0,0028 vs. Fe, IFNγ, P = 0,0001 vs Cont y P = 0,0001 vs Fe, IL1β, P = 0,0047 vs Cont, IL10, P = 0,0013 vs Cont y P = 0,0026 vs Fe) (Fig. 6c-f); la expresión de TNFα e IFNγ fue mayor en el grupo WD + Fe que en el grupo WD (TNFα; P = 0,0352, IFNγ; P = 0,0004). Los macrófagos tisulares se clasifican funcionalmente en tipo M1 activado clásicamente (con propiedades proinflamatorias) y tipo M2 activado alternativamente (con propiedades antiinflamatorias o pro-resolución)33. La inmunohistoquímica reveló que los focos inflamatorios en el hígado de los grupos WD y WD + Fe consistían en macrófagos M1 positivos para iNOS; la inmunorreactividad tendió a ser más intensa en focos inflamatorios grandes (Fig. 6g, indicados por puntas de flecha) que en focos pequeños (microgranuloma; Fig. 6g, flecha) y más intensa en el grupo WD + Fe que en el grupo WD (Fig. S4a complementaria). d). Se observaron esporádicamente macrófagos M2 positivos para CD206 33 en la sinusoide, sin relación directa con focos inflamatorios (Fig. 6h, flecha, Fig. Suplementaria S4e-f). La expresión de ARNm de TNFα también aumentó en el tejido adiposo visceral del grupo WD + Fe, en comparación con los grupos Cont y WD (Fig. S5a complementaria). La expresión de leptina en el tejido adiposo disminuyó en los grupos WD y WD + Fe (Fig. S5b complementaria). La expresión de IL6, adiponectina y genes involucrados en el metabolismo de los adipocitos (PPARγ, Pde3b, Srebf1, Cpt1a, Acaca y Dgat1) no difirió significativamente entre los grupos (Figura complementaria S5c-j).

(a) Imágenes histológicas que representan microgranuloma (flechas) con infiltrado de células mononucleares en el hígado graso del grupo WD y WD + Fe. La inflamación está ausente o es mínima en los grupos Cont y Fe. (b) El número de focos inflamatorios en el lóbulo hepático en la semana 26. Expresión hepática de (c) TNFα, (d) IFNγ, (e) IL1β y (f) ARNm de IL10 en la semana 26. Los datos se normalizaron a ARNr 18S y expresado como cambio de pliegue del control. Los datos se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, †P < 0,05 frente a WD y §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey. Imágenes de IHC para (g) iNOS y (h) CD206 en el grupo WD + Fe en la semana 26. Las flechas indican microgranulomas mientras que las puntas de flecha indican grandes focos inflamatorios. Bar; 50 micras.

Con el fin de aclarar el mecanismo del aumento de la inflamación hepática por la sobrecarga de hierro de la dieta, este estudio se centró en el factor nuclear kappa B (NFκB), un factor de transcripción implicado en las respuestas inmunitarias innata y adaptativa, así como en una serie de inflamaciones patológicas34. La translocación nuclear de NFκB activa la transcripción de genes diana aguas abajo como TNFα34. El nivel de NFκB en la fracción nuclear del hígado aumentó en el grupo WD + Fe (P = 0,03 frente a Cont y P = 0,0163 frente a Fe) (Fig. 7a), mientras que la expresión citoplasmática de NFκB no cambió significativamente entre todos los grupos (Fig. 7b). A continuación, nos centramos en la vía aguas arriba de NFκB. El complejo IκB quinasa (IΚK), que consta de dos quinasas (IΚKα e IΚKβ), es el regulador central de NFκB. La IΚK activada fosforila y degrada la IκB, la proteína de unión de NFκB, lo que da como resultado la translocación nuclear de NFκB34,35. La Akt fosforilada (incluidas Akt1 y Akt2) también se conoce como activador de NFκB a través de la fosforilación de IΚKα36. En este estudio, no hubo cambios significativos en la expresión hepática de IΚK fosforilada (Fig. 7c) y Akt fosforilada (Fig. 7d) entre todos los grupos en nuestro modelo. Además, como se mencionó anteriormente, la expresión hepática de Akt2 fosforilada disminuyó bastante en el grupo WD + Fe (Fig. 5d). La inmunorreactividad de NFκB estuvo presente esporádicamente en el núcleo de las células sinusoidales (probablemente células de Kupffer) de los grupos Cont y Fe (Fig. 7e, h). Se observó inmunorreactividad de moderada a intensa en el núcleo y el citoplasma de las células inflamatorias en los microgranulomas (Fig. 7f, g; flechas negras) y grandes focos inflamatorios (Fig. 7f, g; puntas de flecha negras) en los grupos WD y WD + Fe; algunos hepatocitos alrededor de los focos inflamatorios tenían inmunorreactividad nuclear de NFκB (Fig. 7f, g; flechas blancas).

Expresión hepática de NFκB en las fracciones (a) citoplasmática y (b) nuclear, y (c) fosfo IκB quinasas y (d) fosfo Akt en el lisado de tejido hepático completo en la semana 26. Se usaron GAPDH e histona H2B para un control de carga en todo el tejido/fracción citoplasmática y nuclear, respectivamente. Los datos se expresan como cambio de pliegue del control y se presentan como caja y bigotes (n = 4/grupo). *P < 0,05 frente a Cont, §P < 0,05 frente a Fe mediante ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Tukey. Imágenes de inmunohistoquímica de NFκΒ (p65 o RelA) en los grupos Cont (e), WD (f), WD + Fe (g) y Fe (h). Barra = 50 μm.

La EHGNA se desarrolla en estrecha relación con el MetS, particularmente con la obesidad, la resistencia a la insulina, la DM2 y la dislipidemia4. La alimentación con dieta occidental indujo esteatosis hepática, hiperlipidemia y vía de insulina hepática parcialmente alterada en el presente modelo de rata para NAFLD. Este modelo también representa la inflamación hepática con regulación positiva de citocinas inflamatorias y lesión hepática leve, indicativo de los fenotipos de transición de NAFL a NASH temprano. La adición de una sobrecarga de hierro en la dieta a la dieta occidental resultó en hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, acumulación de hierro hepático, aumento de la peroxidación lipídica hepática y exacerbación de la inflamación hepática con regulación positiva de las citocinas relacionadas con M1 y translocación nuclear de NFκB en el presente modelo WD + Fe. A pesar de la presencia de muchas evidencias que sugieren que el exceso de hierro está involucrado en la patología de NAFLD, el mecanismo no se ha dilucidado completamente ya que la condición de la enfermedad se complica por varios factores como la resistencia a la insulina, el estado inmunológico y el estrés oxidativo4,5. Nuestros resultados sugirieron que la sobrecarga de hierro puede alterar la condición metabólica y aumentar la inflamación hepática en la enfermedad del hígado graso, arrojando luz sobre el vínculo patológico entre NAFLD y DIOS en humanos.

DIOS se define clínicamente sobre la base de los siguientes hallazgos: la presencia de componentes MetS, hiperferritinemia con saturación de transferrina normal y exceso de hierro hepático leve típicamente con acumulación sinusoidal17,18,19,20,21. Sin embargo, la patogenia de DIOS aún se debate. El presente modelo de WD tiene un hierro sérico aumentado con una saturación de transferrina normal, lo que sugiere una capacidad normal de la transferrina sérica para unirse al hierro. La combinación de suplementos de hierro en la dieta con alimentación con dieta occidental induce la acumulación de hierro hepático principalmente a lo largo de la sinusoide con regulación positiva de hepcidina hepática, como en DIOS y NAFLD humanos18,19,20,37. Como se muestra en la Tabla 1, los fenotipos de MetS son similares entre el presente modelo WD + Fe, NAFLD humano y DIOS, lo que sugiere una relevancia fenotípica de este modelo para DIOS humano y NAFLD con sobrecarga de hierro. La ferritina sérica se mide comúnmente como un marcador sustituto de las reservas corporales de hierro en la práctica clínica humana, en lugar de la medición directa del hierro tisular38,39. Sin embargo, la ferritina sérica es independiente de las reservas corporales de hierro en ratas porque contiene solo una pequeña cantidad de hierro40. Por lo tanto, evaluamos el contenido de hierro hepático en nuestro modelo de rata al comparar las condiciones de almacenamiento de hierro corporal con las de los humanos. La ingesta media diaria de hierro en los grupos Fe (485,2 mg/kg de peso corporal/día) y WD + Fe (444,3 mg/kg de peso corporal/día) es aproximadamente 32 veces y 30 veces mayor que en las ratas de control (15,1 mg/kg de peso corporal/día). peso/día), respectivamente. Con el cálculo basado en el peso corporal, la ingesta diaria promedio de hierro en los grupos Fe y WD + Fe es aproximadamente 1777 veces y 1940 veces mayor que en la ingesta diaria promedio de hierro de los hombres (0,25 mg/kg de peso corporal/día), respectivamente41. El contenido de hierro hepático en pacientes con NAFLD con hiperferritinemia y/o hierro sérico anormal es de 980-5070 μg/g de peso seco, lo que es una sobrecarga de hierro normal a leve-moderada en la escala de evaluación de sobrecarga de hierro clínica42,43,44. En el modelo actual de WD + Fe, el contenido de hierro hepático se puede calcular en 858–1574 μg/g de peso seco, lo que sugiere un aumento de normal a leve en el hierro hepático45. Se considera que nuestro modelo WD + Fe tiene un estado de hierro similar al de los pacientes humanos con EHGNA con desregulación del hierro44.

La limitación de los modelos WD + Fe actuales es que la resistencia a la insulina hepática no se altera por completo como en NAFLD y DIOS típicos. La resistencia a la insulina es una parte importante de los "múltiples impactos" que conducen al desarrollo y progresión de NAFLD, junto con la lipotoxicidad, el estrés oxidativo y la activación de la cascada inflamatoria5. La resistencia hepática a la insulina, definida como la supresión alterada de la producción de glucosa por parte de la insulina en los hepatocitos, también es un componente importante de los trastornos metabólicos30,46. La resistencia a la insulina hepática se desarrolla antes que la resistencia a la insulina sistémica, lo que indica que la resistencia a la insulina hepática puede iniciar el desarrollo de resistencia a la insulina en todo el cuerpo47. Se demostró que la vía de la insulina hepática estaba parcialmente alterada en los modelos WD y WD + Fe actuales; sin embargo, la translocación nuclear de FOXO1 no se vio afectada por la regulación negativa de los genes de la glucogénesis. En el hígado, la gluconeogénesis se puede suprimir mediante el desensamblaje dependiente de PDK1 del complejo de proteína de unión al elemento de respuesta cAMP, así como la vía AKT2-FOXO148. En cuanto a los sustratos del receptor de insulina, no solo el IRS1 sino también el IRS2 están involucrados en la inhibición de la producción de glucosa hepática49. Se considera que la glucogénesis podría regularse a través de estas vías alternativas en respuesta a la supresión de IRS1-Akt 2 en este modelo. Se seleccionó el desafío con fructosa y glucosa en el agua potable para alterar la cascada de insulina hepática en este modelo. La solución de fructosa y/o glucosa se ha utilizado ampliamente para inducir fenotipos de MetS en modelos de roedores, ya que se sugiere que la ingesta excesiva de fructosa y glucosa es la causa principal del desarrollo de MetS47,50,51. Sería efectivo aumentar el contenido de azúcar tanto como estudios previos que muestran resistencia a la insulina hepática o sistémica50,52, para obtener una resistencia a la insulina definitiva en nuestro modelo. Otro método para facilitar MetS en nuestro modelo es alimentar la dieta occidental en modelos de diabetes bien establecidos, como modelos inducidos químicamente y modificados genéticamente. El primero incluye un modelo de DM2 con tratamiento con estreptozotocina a dosis bajas53. Sin embargo, cabe señalar que el trastorno de las células β inducido por estreptozotocina es mucho más grave que la patogenia natural53,54. Este último incluye roedores con deficiencia del eje leptina-receptor de leptina (ratón ob/ob, ratón db/db, rata grasa Zucker) y con D2M espontáneo (ratón KK); estos animales desarrollan resistencia a la insulina con la obesidad51,54. La combinación de la inducción de la diabetes con la alimentación con dieta occidental podría producir un mejor modelo que imite más claramente la EHGNA y el síndrome metabólico humanos.

En este estudio, la sobrecarga de hierro en la dieta exacerba la inflamación hepática inducida por la dieta occidental con una regulación al alza de citoquinas como TNFα e IFNγ; Se obtuvieron hallazgos similares en estudios previos con modelos de NAFLD en roedores22,55. Además, se demostró que la exacerbación de la inflamación hepática en el presente modelo WD + Fe está asociada con una intensa acumulación de hierro en macrófagos/células de Kupffer y una mayor translocación nuclear de NFκB. La translocación nuclear de NFκB fue especialmente notable en los focos inflamatorios del modelo WD + Fe. El TNFα se asocia con la obesidad y la resistencia a la insulina, y también se conoce como activador de la inflamación impulsada por el NFκB al unirse al TNFR134,56,57. La expresión de TNFα hepático y adiposo y del receptor de TNFα hepático aumenta en pacientes obesos con EHNA en comparación con los obesos sin EHNA58. De manera similar, la expresión de TNFα aumenta tanto en el hígado como en el tejido adiposo visceral en el presente modelo WD + Fe, lo que sugiere que el TNFα producido en el hígado y el tejido adiposo visceral podría contribuir a la exacerbación de la inflamación hepática. El aumento de la actividad de NFκB también se asocia con el desarrollo de componentes de MetS como esteatosis, resistencia a la insulina hepática e inflamación en roedores5,57,59. La activación de NFκB también está demostrada en las biopsias de hígado de pacientes con EHNA60,61. Además, varios estudios sugieren que el exceso de hierro induce directamente la activación de NFκB y la regulación positiva de TNFα a través de IΚK en células de Kupffer cultivadas62,63. La interacción TNFα-NFκB podría promover la inflamación hepática en el presente modelo WD + Fe. El IFNγ se origina en gran medida a partir de las células T auxiliares y se asocia principalmente con las respuestas inmunitarias de tipo Th164. Aunque los datos sobre el papel de las células Th1 en la NAFLD humana son limitados, se observó un aumento en el número de células T productoras de IFNγ en pacientes con NASH65. El IFNγ también puede activar macrófagos M1 que secretan citoquinas proinflamatorias como TNFα e IL1β33,66. En el modelo WD + Fe actual, los leucocitos mononucleares en los focos inflamatorios fueron fuertemente positivos para iNOS, mientras que son negativos para CD206, lo que sugiere que los macrófagos M1 consisten principalmente en focos inflamatorios. La respuesta inmunitaria Th1/M1 inducida por hierro también podría contribuir al aumento de la inflamación hepática en el presente modelo WD + Fe.

La dislipidemia es una de las principales características clínicas de NAFLD así como MetS con su alta prevalencia (20% a 80% de los pacientes con NAFLD) y se ha señalado como un factor de riesgo para enfermedad cardiovascular67. Estas evidencias respaldarían la utilidad de este modelo, ya que representa el fenotipo importante de NAFLD humano con múltiples componentes de MetS. Además, la sobrecarga de hierro en la dieta aumenta los triglicéridos séricos y el colesterol total, pero no los triglicéridos hepáticos en el presente modelo WD + Fe. Graham et al. demostraron que la carga hepática de hierro aumenta la síntesis de colesterol hepático en ratones68. Además, se muestra que la activación de la vía de señalización de NFκB en los hepatocitos, como se observa en el presente modelo WD + Fe, promueve la lipogénesis, incluida la síntesis de colesterol69. Estos hallazgos sugieren que la sobrecarga hepática de hierro puede alterar el metabolismo de los lípidos, en particular el metabolismo del colesterol.

El estrés oxidativo se considera uno de los "múltiples impactos" de NAFLD y se cree que está asociado con la activación de la señalización inmunitaria innata durante el desarrollo de NAFLD a través de la activación de factores de transcripción como los factores reguladores de interferón y NFκB27,28,70. La sobrecarga de hierro puede inducir lesiones tisulares a través de la generación de radicales hidroxilo, una especie de oxígeno altamente reactiva, por la reacción de Fenton9. Sin embargo, el aumento en el contenido hepático de MDA, un marcador de la peroxidación lipídica28, fue leve (menos del doble) en el presente modelo WD + Fe, sin cambios significativos en las transaminasas séricas o la relación hepática GSH/GSSG, un indicador de estrés oxidativo-antioxidante. equilibrio27. Además, la acumulación de hierro en el hígado fue de leve a moderada en los modelos WD + Fe actuales, como en los pacientes con NAFLD con hiperferritinemia o DIOS19,20. Estos hallazgos sugieren que la cantidad no hepatotóxica de la acumulación de hierro puede promover la dislipidemia y la inflamación hepática a través de la activación de macrófagos/células de Kupffer, en lugar de inducir daño hepático directo en enfermedades metabólicas del hígado.

En conclusión, nuestros resultados demostraron que el nuevo modelo NAFLD con sobrecarga hepática de hierro comparte muchas características de la NAFLD humana con hiperferritinemia y DIOS. La adición de una sobrecarga de hierro en la dieta a la enfermedad del hígado graso inducida por la dieta occidental exacerba la inflamación hepática con la activación de NFκB y altera el metabolismo de los lípidos, lo que sugiere un papel importante del hierro en el desarrollo y la progresión de la NAFLD como uno de los factores de "golpes múltiples". La mejora adicional del modelo experimental aclararía más claramente el vínculo cruzado entre NAFLD humano y DIOS.

El experimento realizado en este estudio se informa de acuerdo con las pautas ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Ratas macho F344/DuCrlCrlj de diez semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Yokohama, Japón) se dividieron en control (Con), dieta occidental (WD) y dieta occidental + alta en hierro (WD + Fe) y alta en hierro. grupos de hierro (Fe) (n = 4 en cada grupo); promedio del peso corporal es similar entre los grupos al comienzo del experimento. Se determinó un tamaño de muestra de cuatro por grupo en términos de reducción (minimizando el número de animales) y precisión experimental (minimizando la influencia de las variaciones individuales). Dos o tres ratas por jaula se mantuvieron en una habitación con temperatura controlada y ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Las ratas recibieron las dietas que se muestran en la Tabla complementaria S1 durante 26 semanas. La dieta alta en hierro se preparó mezclando citrato de hierro (FeC6H5O7・5H2O) a una concentración del 6%. El peso corporal, la ingesta de alimentos y la ingesta de agua se midieron una vez por semana. Después de 26 semanas de alimentación, las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia profunda con isoflurano, y se recogieron sangre entera, hígado, tejido adiposo subcutáneo (inguinal) y visceral (periepididimal), bazo, páncreas, contenido cecal, corazón, riñones y pulmones. . Todas las ratas se incluyeron en los análisis descritos a continuación sin ninguna exclusión. Los factores de confusión no se controlaron en este estudio; sin embargo, la influencia del orden de tratamientos y medidas se considera mínima en cuanto a la observación de los datos obtenidos. Dos de los autores (SF y TI) conocían la asignación de grupos en las diferentes etapas de los experimentos. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de la Prefectura de Osaka (códigos n.º 29–184 y 30–71) y se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Experimentación con Animales de la Universidad Metropolitana de Osaka.

Se recogió sangre de la aorta abdominal y se dejó durante una hora a temperatura ambiente. El suero se separó por centrifugación (3000 rpm, 10 min). Los análisis bioquímicos se realizaron en SRL Inc. (Tokio, Japón).

El lóbulo lateral izquierdo y el caudado del hígado se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se incluyeron en parafina, se cortaron a 5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) para el examen histopatológico. Se contó el número de focos inflamatorios. Se evaluaron diez campos de 200 × de secciones del lóbulo lateral izquierdo de cada animal. Los datos se presentaron como el número de focos inflamatorios por campo de 200 ×.

Para examinar el contenido de triglicéridos en el hígado, se realizó un ensayo de triglicéridos hepáticos con el kit Triglicéridos E-test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Tokio, Japón) según las instrucciones del fabricante.

Las secciones del lóbulo lateral izquierdo y el caudado del hígado se sometieron a inmunohistoquímica (IHC) con anticuerpos primarios como se enumeran en la Tabla complementaria S2. Después del desparafinado y la recuperación del antígeno, las secciones de tejido se inmunoteñeron en un sistema Histostainer (Nichirei Biosciences, Tokio, Japón) como se describió anteriormente71. Brevemente, las secciones se trataron con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min, con cada anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 1 h, con H2O2 al 3 % en PBS durante 15 min y con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. (Histofine Simple Stain MAX PO; Nichirei Biosciences) a temperatura ambiente durante 30 min. Las reacciones positivas se visualizaron con 3,3'-diaminobencidina (kit de sustrato DAB; Nichirei Biosciences). Después de la inmunohistoquímica, las secciones se tiñeron con solución de Perls para la detección de hierro tisular.

Los niveles de insulina sérica se analizaron con el kit ELISA de insulina de rata LBIS (Shibayagi Co., Gunma, Japón) según las instrucciones del fabricante.

Para examinar el cambio de peroxidación de lípidos, los contenidos de MDA hepáticos se analizaron mediante el método de sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARS) utilizando un kit de ensayo de MDA (Northernwest Life Science Specialities, Vancouber, Canadá) como se describió anteriormente71.

Para examinar la actividad antioxidante hepática, se analizó la relación GSSG/GSH hepática utilizando un kit de cuantificación GSSG/GSH (Dojindo, Kumamoto, Japón) según las instrucciones del fabricante.

Se realizó una RT-PCR en tiempo real para examinar los patrones de expresión de los principales genes de citoquinas y genes relacionados con el metabolismo del hierro, como se describió anteriormente71. Las muestras de hígado del lóbulo medio derecho, el tejido graso epididimal y el tejido graso inguinal se sumergieron en ARN más tarde regente (Qiagen, Hilden, Alemania) y se almacenaron a -80 ° C antes de su uso. El ARN total se extrajo utilizando un sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega, WI, EE. UU.). Dos coma cinco microgramos de ARN total se transcribieron inversamente a ADNc mediante el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). La PCR en tiempo real se realizó con ensayos de expresión génica TaqMan (Life Technologies) en un sistema de PCR PikoReal Real-Time 96 (Thermo Scientific, Massachusetts, EE. UU.). Los detalles de las sondas se enumeran en la Tabla complementaria S3. Se usaron 18sRNA eucariótico y βactina como genes de referencia. Los datos se calcularon con el método 2−ΔΔCT.

Se prepararon homogeneizados de tejido completo, del lóbulo medio derecho, como se describió anteriormente71. Para la preparación de las fracciones citoplásmicas/nucleares, las muestras de hígado del lóbulo medio derecho se homogeneizaron en un tampón que contenía HEPES/KOH 10 mM (pH 7,5), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM, NP-40 al 0,5 %, PMSF 1 mM y Cóctel inhibidor de proteinasas. Después de la centrifugación a 3100 xg durante 5 min, el sobrenadante se recogió como fracción citoplasmática. El precipitado se mezcló con 200 μL de otro tampón que contenía HEPES/KOH 10 mM (pH 7,5), NaCl 25 mM, MgCl 3 mM, sacarosa 300 mM, PMSF 1 mM y cóctel inhibidor de proteinasa y se centrifugó a 3100 xg durante 5 min. Después del tratamiento con 10 mg/ml de ADNasa I y sonicación en hielo, la muestra se recogió como fracción nuclear. La concentración de proteínas se determinó mediante un espectrómetro de absorción utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.). Las muestras se separaron en geles de poliacrilamida con un gradiente de 5 a 20 % y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). Las membranas se cortaron en varias piezas por tamaño antes de la incubación con anticuerpos primarios y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios como se indica en la Tabla complementaria S4, seguido de una incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Histofine Simple Stain MAX PO; Nichirei Biosciences) durante 30 min. Las señales se visualizaron con ECL prime (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) y se cuantificaron con un analizador de imágenes luminiscentes (LAS-4000; GE Healthcare). Las imágenes de banda analizadas se muestran en la figura complementaria S6a-m.

Los datos se presentan como media ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey-Kramer con un software Prism (ver. 9.4.1.; GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.; https://www.graphpad.com/scientific-software/ prisma/). Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Laboratorio de Patología Veterinaria, Universidad Metropolitana de Osaka, 1-58 Rinku-Orai-Kita, Izumisano, Osaka, 598-8531, Japón

Sakura Fujiwara, Takeshi Izawa, Mutsuki Mori, Machi Atarashi, Jyoji Yamate y Mitsuru Kuwamura

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Correspondencia a Takeshi Izawa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Fujiwara, S., Izawa, T., Mori, M. et al. La sobrecarga de hierro en la dieta aumenta la inflamación hepática inducida por la dieta occidental y altera el metabolismo de los lípidos en ratas que comparten similitudes con el DIOS humano. Informe científico 12, 21414 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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Recibido: 27 junio 2022

Aceptado: 06 diciembre 2022

Publicado: 10 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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